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組織工程學(xué)概況組織工程學(xué)是根據(jù)細胞生物學(xué)、材料科學(xué)和生物工程學(xué)的原理，構(gòu)建生物替代物以維持、修復(fù)損傷組織和器官功能的一門科學(xué)。

組織工程的治療策略通常分為兩類:①利用脫細胞基質(zhì)(acellularmatrixgraft，ACMG)，為新組織生長提供正確定位、定向，依靠機體自身的再生能力促進組織再生。脫細胞基質(zhì)通常是應(yīng)用機械和化學(xué)的方法去除組織中細胞成分后的富含膠原的基質(zhì)。②利用接種細胞的脫細胞基質(zhì)構(gòu)建新的組織器官。

組織工程尿道重建的基礎(chǔ)研究應(yīng)用ACMG修復(fù)尿道缺損的研究已有多年，包括尿道細胞外基質(zhì)(urethralextracellularmatrix，UECM)、膀胱黏膜下層(bladderacellularmatrixgraft，BAMG)、小腸黏膜下層(smallintestinesubmucosa，SIS)等，它們經(jīng)過脫細胞處理后，僅保留膠原蛋白、蛋白多糖等低抗原性物質(zhì)。楊嗣星等［3］應(yīng)用UECM進行兔的尿道缺損修復(fù)實驗。術(shù)后3周，尿路上皮完全覆蓋細胞外基質(zhì)，術(shù)后6周，平滑肌細胞再生，炎性細胞消失，術(shù)后24周，再生尿道組織與正常尿道組織無區(qū)別。Chen等［4］應(yīng)用豬BAMG修復(fù)兔尿道缺損，術(shù)后尿路造影顯示尿道連續(xù)無狹窄，術(shù)后2個月BAMG表面覆蓋完整的尿路上皮細胞，術(shù)后3個月炎性細胞消失，未見瘢痕形成，術(shù)后6個月黏膜下肌纖維束基本成形。Nuininga等［5］采用SIS以鑲嵌補片方式修復(fù)兔的尿道缺損，術(shù)后尿道造影顯示所有試驗動物尿道口徑正常無狹窄，術(shù)后1個月尿路上皮細胞完整覆蓋SIS，炎癥細胞浸潤，術(shù)后3個月炎癥細胞消失，平滑肌細胞再生。盡管采用單純脫細胞基質(zhì)以補片的方式進行尿道修復(fù)已取得較好的效果，但如果尿道損傷較大甚至閉鎖，單純的全管狀材料修復(fù)，療效不佳。修復(fù)段尿道出現(xiàn)萎縮，尿道黏膜下出現(xiàn)雜亂無序的肌束，尿道造影顯示尿道狹窄形成［6］，其原因可能是由于尿道的缺損過長，宿主的滋養(yǎng)血管延伸到缺損中心區(qū)域較為困難，缺乏血供的上皮細胞爬行能力減弱，難以覆蓋整個創(chuàng)面，并且支架降解較早，宿主的自體細胞尚未完全覆蓋其上所致，而將種子細胞接種于管狀膠原基質(zhì)材料修復(fù)長段管狀化尿道缺損則成為一種更好的選擇。DeFilippo等［7］分別用未接種細胞和接種細胞的管狀BAMG修復(fù)兔尿道缺損，發(fā)現(xiàn)單純用管狀基質(zhì)修復(fù)的尿道，重建尿道狹窄并纖維化形成，而接種了自體細胞的管狀膠原基質(zhì)，重建尿道連續(xù)無狹窄發(fā)生。傅強等［8-9］用植入包皮表皮細胞的BAMG修復(fù)管狀化尿道缺損，術(shù)后3個月修復(fù)段尿道已全部被黏膜覆蓋，黏膜光滑，管腔無明顯狹窄，組織學(xué)顯示術(shù)后修復(fù)段尿道上皮呈表皮細胞形態(tài)并與宿主尿路上皮存在明顯分界線，經(jīng)長期隨訪觀察發(fā)現(xiàn):術(shù)后6～12個月，修復(fù)段尿道黏膜出現(xiàn)乳頭樣結(jié)構(gòu)，與尿路移行上皮細胞較為相似，這表明了在長期尿路環(huán)境中，來源包皮的表皮細胞可以向移行上皮形態(tài)轉(zhuǎn)化。Gu等［10］應(yīng)用硅膠管以腹膜腔作為生物反應(yīng)器構(gòu)建自身管狀尿道修復(fù)材料，組織學(xué)證實成肌纖維細胞種植于膠原基質(zhì)，其外有單層間皮細胞。將此修復(fù)材料對兔的尿道缺損進行尿道重建，術(shù)后尿道造影顯示尿道連續(xù)無狹窄，此項研究為我們修復(fù)管狀化尿道缺損提供了新的思路。

組織工程尿道重建的臨床研究Atala等［11］采用BAMG修復(fù)傳統(tǒng)手術(shù)治療失敗的尿道下裂，新建尿道長度為5～15cm，術(shù)后1年尿道造影顯示尿道連續(xù)無狹窄，組織學(xué)證實重建尿道表現(xiàn)為典型的尿路上皮，術(shù)后隨訪22個月，除1例新建尿道出現(xiàn)陰莖頭下瘺管外，其余患者均治愈。EL-Kassaby等［12］用BAMG對28例尿道狹窄患者進行尿道修復(fù)，新尿道長1．5～16cm，術(shù)前和術(shù)后常規(guī)行排尿記錄、體檢、逆行尿路造影、尿流率和膀胱鏡檢查，術(shù)后隨訪36～48個月，僅有4例患者在吻合部位出現(xiàn)輕度狹窄，其余患者治愈，活檢組織學(xué)檢查顯示典型的尿路上皮。Palminteri等［13］應(yīng)用SIS為20例尿道狹窄患者行尿道重建，17例患者尿道狹窄治愈，術(shù)后3個月膀胱鏡檢顯示重建尿道口徑正常無狹窄，但支架部位未被尿路上皮完全替代，原因可能是尿路上皮再生完全至少需要20周才能完成。Fiala等［14］用同樣材料修復(fù)50例尿道狹窄患者，成功率80%，隨訪期間大部分患者均未出現(xiàn)早期或晚期相關(guān)并發(fā)癥，進一步證實SIS在組織工程尿道重建中的應(yīng)用前景。Farahat等［15］近來采用內(nèi)窺鏡技術(shù)對10例復(fù)發(fā)性尿道狹窄患者行SIS補片修復(fù)，術(shù)后8例患者尿道狹窄治愈，僅2例患者表現(xiàn)為輕度的尿道狹窄復(fù)發(fā)，通過定期行尿道擴張術(shù)已獲得滿意的治療效果。

目前，口腔黏膜替代已被認為是臨床治療尿道狹窄或下裂一類疾病的金標準［13］，但自體取材可導(dǎo)致張口受限、供體部位麻木感等諸多并發(fā)癥［16-17］。因而構(gòu)建組織工程化口腔黏膜是進行尿道重建的一項新選擇。Bhargava等［18］將角化細胞、成纖維細胞分別從獲取的口腔黏膜表皮層、真皮層分離下來，進行體外培養(yǎng)擴增，達到足夠數(shù)量后將兩種細胞種植在去表皮層的真皮上，構(gòu)建組織工程化口腔粘膜。將其植入5例患者體內(nèi)修復(fù)尿道狹窄，3名患者目前尿道狹窄治愈，1例因術(shù)后陰莖體部纖維化合并陰莖痛性勃起需做全段補片切除，另1例因補片的過度增生及纖維化需做部分補片切除，該研究為組織工程化口腔粘膜的臨床應(yīng)用展現(xiàn)了新的前景。Selim等［19］將角化細胞與成纖維細胞種植在聚乳酸(polylacticacid，PLA)與聚羥基乙酸(polyg-lycolicacid，PGA)的共聚物PLGA(polylactic-co-glycolicacid)上，構(gòu)建組織工程化口腔黏膜，其機械強度和彈性約為正常口腔黏膜的30%，為PLGA在尿道組織工程中的應(yīng)用開創(chuàng)了新的前景。2干細胞的研究概況干細胞(stemcells，SC)是一類未分化的細胞，具有自我更新的能力并能進行分化以最終形成成熟的非再生細胞和效應(yīng)細胞［20-21］。根據(jù)分化的不同階段，主要分為:全能干細胞(受精卵)、多潛能干細胞(胚胎干細胞)、多能干細胞(成體干細胞)、單能干細胞(祖細胞)［22］。目前研究最多的是胚胎干細胞(embryonicstemcells，ESCs)和成體干細胞(A-dultstemcells)。

干細胞在尿道重建中的基礎(chǔ)研究理論上ESCs依靠其多分化能力可作為理想的種子細胞，但獲取胚胎干細胞往往造成胚胎的破壞，并且將其植入免疫缺陷動物時，有形成畸胎瘤的風險［23］。Otta-masathien等［24］研究表明在裸鼠的腎被膜下，胚胎干細胞在胚胎膀胱間充質(zhì)(embryonicbladdermesen-chyme，EBLM)誘導(dǎo)下產(chǎn)生膀胱上皮細胞和平滑肌細胞，并無畸胎瘤的生成。Mauney等［25］應(yīng)用全反式維甲酸在體外成功將胚胎干細胞誘導(dǎo)成尿路上皮細胞，為胚胎干細胞作為組織工程種子細胞的來源提供了可能性。Frimberger等［26］用種植人胚胎干細胞的豬小腸黏膜下層修復(fù)大鼠膀胱缺損，術(shù)后28天，膀胱上皮層、粘膜下層和平滑肌層完全再生。成體干細胞來自骨髓、肌組織、血管內(nèi)皮、皮膚及脂肪等處，可避免獲取胚胎干細胞時的倫理問題，同時成體干細胞不會轉(zhuǎn)化為惡性表型，降低了植入體內(nèi)后形成畸胎瘤的風險，所以研究者們的目光現(xiàn)已逐漸轉(zhuǎn)移到對成體干細胞的研究。Shukla等［27］研究顯示骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrow-derivedmesen-chymalstemcells)在體外可以成功誘導(dǎo)為平滑肌細胞，但將骨髓間充質(zhì)干細胞與SIS復(fù)合進行豬膀胱擴增替代術(shù)時，術(shù)后免疫染色和組織化學(xué)證實骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)并未完全分化為平滑肌細胞，近來已有研究報道骨髓間充質(zhì)干細胞用于膀胱擴增替代術(shù)時可在體內(nèi)成功分化為平滑肌細胞［28］。因為膀胱構(gòu)建與尿道重建在生物支架及種子細胞選材上的相似性，因此可借鑒前者指導(dǎo)干細胞在尿道重建上應(yīng)用。黃紅軍等［29］用種植骨髓間充質(zhì)干細胞的脫細胞尿道海綿體-尿道基質(zhì)(Acellularspongybodyofurethra-urethralmatrix)修復(fù)兔海綿體尿道缺損，術(shù)后僅1例發(fā)生尿瘺，其余排尿通暢。組織學(xué)檢查:術(shù)后2周見少量毛細血管及平滑肌細胞生長，再造尿道腔面完整覆蓋單層尿道上皮，術(shù)后24周，平滑肌細胞增多，排列規(guī)則，尿道黏膜層由七八層上皮細胞構(gòu)成，尿道腔面光滑、完整。但是，由于骨髓間充質(zhì)干細胞在骨髓中含量極低，需體外擴增較長時間才能達到構(gòu)建的細胞數(shù)量;同時由于存在著骨髓抽取過程患者較痛苦等問題，使骨髓來源的干細胞在應(yīng)用中存在較大的局限性。相對而言，脂肪組織來源豐富，只需要簡單的吸脂手術(shù)即可獲得足夠數(shù)量的脂肪組織，且脂肪組織中脂肪干細胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)含量豐富，僅需要少量的脂肪組織即可獲得足夠的ADSCs。ADSCs已經(jīng)證明與骨髓間充質(zhì)干細胞有相似的多潛能和自我更新能力［30］，可以誘導(dǎo)分化為具有正常收縮舒張功能的平滑肌細胞［31-32］。Brzoska等［33］實驗表明脂肪干細胞經(jīng)體外全反式維甲酸誘導(dǎo)培養(yǎng)可分選出大于80%的上皮細胞，Liu等［34］研究進一步表明，將人ADSCs與尿路上皮細胞混合培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)ADSCs向尿路上皮細胞轉(zhuǎn)化。

以上結(jié)果表明脂肪干細胞可誘導(dǎo)分化出上皮和平滑肌細胞從而可能作為種子細胞應(yīng)用于尿道組織工程的修復(fù)重建。張亞等［35］應(yīng)用ADSCs復(fù)合多孔絲素膜(poroussilkfibroinscaf-fold，PSFS)修復(fù)兔的尿道缺損，術(shù)后2周絲素膜結(jié)構(gòu)完整，表面無尿路上皮細胞形成，膜基底部有血管、膠原組織生長，少量淋巴細胞浸潤。術(shù)后4周絲素膜表面形成3～4層排列欠規(guī)則的尿路上皮細胞，黏膜下見大量血管、平滑肌細胞沿絲素膜孔隙生長。術(shù)后6周絲素膜表面見排列規(guī)則的6～7層尿路上皮細胞，絲素膜被分解成小塊狀。與單純應(yīng)用多孔絲素膜修復(fù)尿道缺損相比，ADSCs復(fù)合PSFS能加快血管生長、促進尿路上皮及平滑肌細胞生長和加速絲素膜的分解。該研究進一步證實了以干細胞作為種子細胞構(gòu)建組織工程化尿道是可行的。Wu等［36］應(yīng)用尿液樣本中獲取的尿源性干細胞(urine-derivedstemcells，USC)經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)傳代3次，50%～70%尿源性干細胞分化為平滑肌細胞，超過90%尿源性干細胞分化為尿路上皮細胞。每200ml尿液樣本獲取的尿源性干細胞在培養(yǎng)傳代4次時即可產(chǎn)生至少3．2×108個活性細胞，足以用來構(gòu)建工程化的尿道組織。

干細胞在尿道重建中的臨床展望目前，臨床上進行尿道修復(fù)較多應(yīng)用天然或人工的生物支架材料，但如果尿道缺損面積過大乃至閉鎖，單純脫細胞膠原基質(zhì)的管狀修復(fù)效果不理想［37］，采用體外預(yù)先植入自體上皮細胞的膠原基質(zhì)進行尿道修復(fù)可顯著改善這一難題，但往往存在種子細胞選擇的問題，干細胞研究為泌尿系組織工程種子細胞開辟了新的途徑［38］。盡管干細胞顯示出巨大的臨床應(yīng)用前景，但在實際研究中仍存在許多問題:①技術(shù)問題，目前干細胞在尿道重建中的研究僅限于實驗動物階段，在干細胞的純化、誘導(dǎo)方面仍缺乏有效的方法［39］;②倫理學(xué)問題，特別是胚胎干細胞的應(yīng)用常受到社會的強烈反對［40］;③方法問題，對于植入未分化狀態(tài)的細胞還是分化狀態(tài)的細胞仍有較大爭議。因此如何解決好技術(shù)、倫理和方法問題仍將是今后一段時間干細胞臨床應(yīng)用所面臨的主要問題。3前景隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，組織工程和干細胞技術(shù)作為再生醫(yī)學(xué)的重要組成部分在許多方面取得了重大進展，為尿道的修復(fù)重建提供了新的思路和廣闊的前景。臨床已成功應(yīng)用小塊的工程化組織修復(fù)尿道缺損，但大塊的工程化組織卻不能盡快建立血液循環(huán)，易發(fā)生缺血壞死;干細胞的應(yīng)用進一步拓寬了種子細胞的來源，但存在倫理問題和致瘤性的風險。因此，如何促進組織工程化尿道的血管化以及如何純化、誘導(dǎo)干細胞可能將是今后研究者們在組織工程尿道重建領(lǐng)域進一步探索的方向。

作者:王營、傅強單位：上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院