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1材料與方法

試驗動物選用5只成年太行青山羊公羊，對其實施閹割手術，采集睪丸組織，放入已處理過的凍存管后投入液氮保存。RNA提取依照說明書操作要求提取山羊睪丸總RNA，通過核酸蛋白測定儀檢測純度、濃度及和，然后瓊脂糖變性電泳檢測RNA的完整性，貯存于－80℃冰箱。1．3引物設計根據(jù)中公布的人、鼠、牛、綿羊基因同源序列的序列進行分析，在高度保守區(qū)域設計擴增序列特異性引物SP1，5’RACE和3’引物根據(jù)生物公司．試劑盒操作說明要求，通過Primer5．0軟件設計，引物交由上海生物工程公司合成，試驗所用引物序列?；蛉Lc克隆基因cDNA中間片段克隆使用SYBR?中的反轉錄反應試劑進行反轉錄實驗，構建10μL反轉錄體系：．5μL，R；反應條件：。mRNA轉錄為cDNA后用作后續(xù)PCR模板，擴增引物SP1，構建15μL體系：cDNA模板聚合酶；反應條件：94℃預變性個循環(huán)；72℃延伸8min。反應結束后1％的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。和5’RACE擴增以提取的山羊睪丸組織總RNA為模板，嚴格按照TaKaRa生物公司試劑盒說明進行3’RACE和5’RACE擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)割膠回收、連接轉化、定向克隆至，測序。序列分析分段擴增及RACE獲得的山羊基因序列利用DNAStar軟件中的SeqMan程序拼接，拼接產(chǎn)物（核酸序列）用DNAStar軟件中的EditSeq程序翻譯成氨基酸序列。并通過

2結果與分析

基因cDNA特異片段及RACE擴增結果本試驗從成年太行青山羊睪丸組織提取的RNA進行cDNA第一條鏈的合成，然后以山羊睪丸cDNA第一鏈為模板，用R引物進行擴增基因cDNA特異性片段，產(chǎn)物經(jīng)1．2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下成像分析，觀察到一條帶，為900bp左右，與預期的目的條帶大小相符，說明擴增成功。以合成的RACEcDNA為模板，通過套式PCR反應，3’RACE和5’RACE分別擴增得到約250bp、1000bp的片段（圖1），將所得產(chǎn)物進行純化，與pMD18－T載體連接，轉化到感受態(tài)細胞，篩選單克隆質(zhì)粒后送上海生工測序，經(jīng)結果表明，該序列屬于基因3’端和5’端序列。基因cDNA全長序列分析結果cDNA全長序列的獲得用DNAS－TAR軟件SeqMan程序?qū)T－PCR和RACE產(chǎn)物測序結果進行拼接分析，山羊cDNA全長序列為，包含有960bp的開放閱讀框，編碼319個氨基酸。該基因3’非翻譯區(qū)長87bp，3’非翻譯區(qū)有真核生物典型的PolyA加尾結構。功能結構域的預測應用SMART服務器分析對結構域功能進行預測，發(fā)現(xiàn)在319個氨基酸序列中，73到115之間有一個“pKID”區(qū)域，259～316之間含有一個典型的“BRLZ”結構，說明屬于bZIP轉錄因子家族。跨膜區(qū)分析用ExPASy提供的在線TM－HMM跨膜區(qū)預測軟件分析山羊氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)。二級結構的預測通過GOR方法對二級結構預測分析結果如圖5顯示，山羊蛋白由α－螺旋（約占37．30％），β－折疊（約占18．81％）和卷曲螺旋3種模塊組成，以α－螺旋和卷曲螺旋為主三級結構預測通過SWISS－MODEL軟件在線預測所推導的山羊蛋白三級結構。以PDB數(shù)據(jù)庫中的1kdxB（99．9）被選定為模板，待測蛋白質(zhì)與模板的序列相似性達到88．889％，建模的氨基酸由82～108，評估值為2．33172e－05，符合建模標準。預測模型?？梢?，山羊蛋白三級結構包括兩個核心螺旋。運用Swiss－PdbViewer軟件進行模型質(zhì)量評價。圖8為預測3D模型的拉氏構象圖。從結果可以看出，氨基酸在拉氏構象圖中較集中的位置形成二級結構，基本判斷3D模型是合理的。三級結構預測結果顯示螺旋結構的全部氨基酸在第三象限的黃色區(qū)域內(nèi)，說明模型可信度高。序列多重比對和分子進化樹分析將山羊基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列分別與GenBank中已登錄的牛、綿羊、狗、人、褐鼠的基因進行比較，結果顯示核苷酸同源性分別為，氨基酸同源性分別為。并用基于氨基酸序列的NJ法構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示山羊與牛親緣關系最近，人次之，與小鼠、褐鼠、馬、狗和綿羊的親緣關系較為相近，與鮭魚的親緣關系最遠。

3討論

自1991年Foulkes等首次獲得小鼠基因cDNA序列，隨后許多物種的基因cD－NA序列被成功克隆。本研究通過RACE技術成功克隆得到全長1183bp山羊基因cDNA序列，包含有960bp的開放閱讀框，編碼319個氨基酸。該基因3’非翻譯區(qū)長87bp，3’非翻譯有真核生物典型的PolyA加尾結構。3’非翻譯區(qū)有一個“ATTTA”序列，與RNA的穩(wěn)定性有關。山羊基因cDNA序列與牛相似，3’非翻譯區(qū)僅存在一個PolyA位點，區(qū)別于小鼠等其他哺乳動物基因的3’末端的兩個polyA位點。對氨基酸序列預測發(fā)現(xiàn)包含兩個富含谷氨酸結構域，一個PKA磷酸化位點，以及一個堿性亮氨酸拉鏈結構域，均屬于CREB亞族典型的功能結構域，表明本研究克隆出的基因cDNA序列及氨基酸序列屬于典型的bZIP轉錄因子家族。通過應用SMART服務器對結構域功能進行預測，發(fā)現(xiàn)在319個氨基酸序列中，73～115之間有一個“pKID”區(qū)域，259～316之間含有一個典型的“BRLZ”結構，pKID區(qū)域為激酶誘導結構域，是蛋白激酶對蛋白進行磷酸化的部位，是激活蛋白必不可少的區(qū)域“BRLZ”結構為bZIP結構域，其主要作用是調(diào)控蛋白／DNA的相互作用，二聚化是蛋白結合DNA所必需的，二聚化的蛋白與CRE啟動子元件結合?，F(xiàn)已證實，許多參與精子發(fā)生過程的基因，其啟動子位點均含有CREs。因此，bZIP區(qū)對發(fā)揮正常的生物學功能是必需的，而且也是保守的。CDS序列同源性分析結果表明，與牛、綿羊、狗、人和褐鼠同源性分別為，氨基酸序列同源性分別為，說明在進化過程中具有較高的保守性。蛋白質(zhì)的生物功能很大程度上取決于其空間結構，致使蛋白質(zhì)結構的預測成為了目前研究的熱門課題。二級結構預測分析結果顯示，山羊蛋白有α－螺旋、β－折疊和卷曲螺旋3種模塊，以α－螺旋和卷曲螺旋為主。通過同源建模，與PDB數(shù)據(jù)庫中1kdxB（99．9A）三維結構高度相似，通過的三級結構和拉氏構象圖同樣也驗證了蛋白結構非常保守。本試驗通過對山羊cDNA序列成功克隆，并對其進行生物信息學分析，為后續(xù)深入探討山羊蛋白生物學功能打下基礎。

作者：施力光荀文娟張春香單位：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院