前言：想要寫出一篇令人眼前一亮的文章嗎？我們特意為您整理了5篇簡歷篩選范文，相信會為您的寫作帶來幫助，發(fā)現(xiàn)更多的寫作思路和靈感。

簡歷篩選范文第1篇

在準(zhǔn)備簡歷素材、挑選簡歷格式、著手創(chuàng)作簡歷的過程中,有一句話,可以用來作為戒條:Your resume is scanned, not read(YRIS)。為什么讓求職者以此為鑒呢 因?yàn)檎衅刚呔褪沁@樣在做。

“篩選,篩選,自然是先篩后選。”招聘人員篩選簡歷時(shí),“電眼”一開,只需5秒鐘左右就可以得出掃描結(jié)果。寫得好的簡歷先放在要保留的那一摞兒,一會兒慢慢看;而寫得不好的簡歷(格式不規(guī)范、打印不工整的簡歷)則會被毫不猶豫地扔進(jìn)垃圾桶。垃圾桶被招聘人員習(xí)慣地戲稱為“人才庫”,所以你得到的回復(fù)可能是“我們已經(jīng)把你的簡歷放進(jìn)了公司的‘人才庫’,以后有合適的機(jī)會我們會予以考慮”。

任何一個(gè)知名的大公司,每天都有成百上千人遞上簡歷,如果你的簡歷寫得太差,它們根本就不會為你保留。因?yàn)檫@些公司認(rèn)為,一個(gè)人連推銷自己的簡歷都寫不好,將來進(jìn)了公司,自然不能打動客戶、贏得訂單。公司肯定不會要說件事情也含糊其辭,讓人完全不知所云的人。

簡歷要控制在一頁之內(nèi)

YRIS還說明寫的內(nèi)容千萬不要多,而且要控制在一頁內(nèi),因?yàn)闆]有人會認(rèn)真看你的簡歷。一方面,簡歷要寫得精練;另一方面,簡歷也要力求精彩。你會問:“萬一簡歷寫得好,短時(shí)間內(nèi)招聘人員看不出來怎么辦 ”這種擔(dān)心沒有完全必要,因?yàn)檎衅溉藛T就靠這“吃飯”,你千萬不要質(zhì)疑他們的專業(yè)素養(yǎng)和效率。

如果你懷疑招聘人員看不出你簡歷的好壞,那么只有兩種解釋:第一,你對招聘人員的工作性質(zhì)還不了解。假設(shè)你是出租司機(jī),經(jīng)常在北京的大街小巷里出出入入,自然對北京的胡同了如指掌,而一般的行人就會覺得很難記住。第二,說明你對專業(yè)簡歷的行文格式還不熟悉。美國很多職位很高的大老板,在看下屬寫的東西時(shí),一點(diǎn)點(diǎn)小錯(cuò),哪怕?lián)Q了一種字體,漏了一個(gè)逗號,多了一個(gè)空格,都能及時(shí)指出來,因?yàn)樗麄兊膶I(yè)素養(yǎng)高,練就了一雙“火眼金睛”。你對他專業(yè)素養(yǎng)的質(zhì)疑,無疑表明你不了解這類公司、這個(gè)行業(yè)。即使你進(jìn)了這種公司,如果不注重提高,也很難成為他們當(dāng)中合格的一員。

原寶潔公司人力資源部經(jīng)理,現(xiàn)任拓晟人力資源管理咨詢公司執(zhí)行董事王拓軒先生說:

中國人善于“遣詞造句”,喜歡運(yùn)用夸張手法和美麗動人的詞句,只要覺得可能會給自己的顏面增光,都會大筆一揮,“信手拈來”,不計(jì)后果。在面試中,作為招聘者,雖然我們會按照招聘的要求進(jìn)行提問,但是如果應(yīng)聘者的簡歷中提到了一些新奇的話題、突出的成績或者明顯不合邏輯的工作內(nèi)容,我們會給予高度重視,問個(gè)清楚。也就是說,“簡歷中的任何字句,都有可能成為面試中的話題”。

簡歷篩選范文第2篇

ABB(中國)有限責(zé)任公司

人力資源經(jīng)理唐煒女士

篩選標(biāo)準(zhǔn)：言簡意賅的簡歷最受歡迎

首先，ABB是根據(jù)每個(gè)職位的崗位描述和招聘需求來篩選簡歷的。之后，人力資源經(jīng)理把選中的簡歷發(fā)到對應(yīng)的業(yè)務(wù)部門進(jìn)行第二輪篩選。在業(yè)務(wù)部門經(jīng)理和人力資源經(jīng)理溝通、協(xié)商之后，產(chǎn)生面試名單。

一份干凈整潔、言簡意賅的簡歷是最受ABB歡迎的，長度在2到3頁紙比較合適。個(gè)人信息、工作經(jīng)驗(yàn)的敘述越接近招聘職位的要求越容易贏得入圍機(jī)會，而那些特別精美或者花里胡哨的簡歷并不見得就受歡迎。簡歷的真實(shí)內(nèi)容才是我們考核的重點(diǎn)。

簡歷篩選范文第3篇

[關(guān)鍵詞] 近海水溶液 耐鹽堿水稻

[中圖分類號] S517 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1003-1650 （2013）10-0108-02

吉林省鹽堿地是世界三大蘇打鹽堿土分布區(qū)之一，鹽堿地面積96.90萬公頃，其中輕度鹽堿地6.07萬公頃，占鹽堿地面積的6.26%，中度鹽堿地46.41萬公頃，占鹽堿地面積的47.90%，重度鹽堿地面積為44.42萬公頃，占鹽堿地面積的45.84%。本區(qū)鹽堿地具體分布于白城市的洮南、洮北、鎮(zhèn)賚、通榆、大安；松原市的長嶺、乾安、扶余、前郭、寧江；四平市的雙遼、梨樹；長春市的農(nóng)安等13個(gè)市縣。鹽堿地面積最大的分布在白城地區(qū)，占吉林省總面積的65%以上。大面積的鹽堿地嚴(yán)重制約著吉林省西部農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展及人民生活水平的提高。據(jù)測定，這里的鹽堿土，可溶性鹽含量高，其電導(dǎo)率 4 毫姆歐/厘米（25℃） ，堿化度 15，pH 8 以上，地下礦化度 1～1.5 克/升，地下水和土壤中含大量的碳酸鈉和碳酸氫鈉，約占全鹽量的 80～90，主要鹽堿成分與海洋所含鹽堿成分相似。本研究通過配制類似成分構(gòu)成的近海水溶液，在實(shí)驗(yàn)室篩選出可在鹽堿地種植具有極強(qiáng)耐鹽堿特性的水稻品種，對鹽堿地改良，改善西部生態(tài)環(huán)境，乃至對吉林省增產(chǎn)百萬斤糧食具有重要的意義。

一、近海水溶液含鹽成分的配制及供試材料的選擇

1.近海水溶液含鹽成分的配制

依據(jù)上一項(xiàng)研究結(jié)果，我們可以確定Na+的含量、CO32-的含量、pH 值三項(xiàng)指標(biāo)作為土壤鹽堿性評價(jià)的主要指標(biāo)，另根據(jù)樣本無機(jī)元素測定分析，我們參照Sverdrup，H.U.1942使用的鹽分構(gòu)成，制成接近海水成分構(gòu)成的含鹽母液（見表1）。

2.用于種子發(fā)芽處理的溶液配制

取150 mL配制好的海水母液，加入蒸餾水，用電導(dǎo)儀測定其電導(dǎo)率，分別配制成電導(dǎo)率為0、2.2、3.2、4.2、5.2和6？2 mΩ/cm的溶液處理種子，共計(jì)6種濃度，即6個(gè)處理。將6種不同電導(dǎo)率的處理溶液200 mL分別裝在塑料盆中，以便供給種子萌動發(fā)芽。

3.供試材料

該試驗(yàn)選用長白9號，長白10號，白粳1號，白稻6，白2029，農(nóng)大10，通790，通育313，綏粳4，0506，0529，0530， 0541，0552， 0561 ，0569，0590，0592，0997等19個(gè)品種或品系參加試驗(yàn)。

二、種子發(fā)芽試驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果

將每個(gè)試驗(yàn)材料的種子隨機(jī)選取100粒，3次重復(fù)，用3%NaOCl溶液滅菌10 min后，分別裝入培養(yǎng)皿中，試驗(yàn)用的培養(yǎng)皿、濾紙、紗布等均用高壓滅菌鍋在121℃、1個(gè)大氣壓下滅菌20 min。已滅菌的培養(yǎng)皿底部用2層濾紙鋪墊，種子上面用長條形紗布的一端蓋好，在實(shí)驗(yàn)室利用不同濃度的近海水溶液，通過加入不同劑量Na2CO3以調(diào)節(jié)溶液的PH值，模擬堿脅迫水稻的發(fā)芽和生長。

以水稻發(fā)芽期的發(fā)芽勢和發(fā)芽率的相對堿害率以及幼苗前期的根數(shù)、根長和苗高的相對堿害率為鑒定評價(jià)指標(biāo)，研究水稻發(fā)芽期和幼苗前期耐堿性鑒定的堿脅迫條件，同時(shí)篩選出耐鹽堿的水稻品種（品系）。

2.種子發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果與分析

從表2可以看出，電導(dǎo)率在2.2～4.2mΩ/cm之間時(shí)，水稻種子發(fā)芽率與對照比，基本上沒有什么變化，當(dāng)超過電導(dǎo)率4.2mΩ/cm時(shí)，種子發(fā)芽率有了明顯的變化，而當(dāng)電導(dǎo)率在4.2～5.2mΩ/cm之間時(shí)，則發(fā)芽率都會受到抑制而不能正常發(fā)芽。因此，說明電導(dǎo)率在2.2～6.2 mΩ/cm之間，各試驗(yàn)材料對鹽分的應(yīng)力區(qū)別較大，我們將發(fā)芽率劃分為4個(gè)級別，分別代表極弱：發(fā)芽率90%，則篩選出2個(gè)在鹽脅迫下具有極強(qiáng)發(fā)芽能力的品種，即為長白9號和白2029；選出白粳1號等7個(gè)具有強(qiáng)發(fā)芽能力的品種。

三、耐鹽堿水稻品種田間鑒定

1.參試材料

本試驗(yàn)對利用鹽脅迫發(fā)芽率試驗(yàn)篩選出來的2個(gè)具有極強(qiáng)發(fā)芽能力，7個(gè)強(qiáng)發(fā)芽能力，以及中等和較弱的10個(gè)品種，合計(jì)19個(gè)試驗(yàn)材料（品種名稱見表2），在田間進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)其耐鹽堿性。

2.田間耐堿性鑒定方法

2.1選擇一小塊鹽堿稻田修成小池子（檢測pH=8.9），將PH值調(diào)制9.0。根據(jù)試驗(yàn)所需的灌水量，準(zhǔn)備一定容積的水桶，以淡水和堿（Na2CO3）混合調(diào)配至pH=9.0（20℃）。用此水灌溉，2～3d更換一次，以防止蒸發(fā)或降雨而引起水層堿濃度變化。若水層堿濃度無大變化，換水時(shí)間可延長，堿水深度保持3～5cm。

2.2移栽和管理：經(jīng)種子消毒和浸種，將催芽的種子播在育苗盤育苗。插秧前施足基肥，用混合好的堿水泡田。在3～4葉齡期，將秧苗單本移栽到試驗(yàn)區(qū)中。行株距20×10cm，單本插秧，每個(gè)試驗(yàn)材料5行，每行栽20株，順序排列，不設(shè)重復(fù)。每5個(gè)品種設(shè)一個(gè)對照品種（長白9號）。

2.3調(diào)查時(shí)間：堿脅迫處理第30天和第60天調(diào)查堿害癥狀。

2.4調(diào)查項(xiàng)目：堿脅迫處理區(qū)平均死亡率。

四、結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)可以看出，參試材料田間復(fù)核鑒定與鹽脅迫下的種子發(fā)芽能力具有一致性。綜合兩種方法，耐鹽堿強(qiáng)弱根據(jù)死葉率判定，某一級別中若在中值前，定為和目視法鑒定結(jié)果一致（0552試材，目測結(jié)果中，死葉率測定弱，但在中值前，故判定為中）；某一級別中若在中值之后，定為和死葉率鑒定結(jié)果一致（0561試材，目測結(jié)果中，死葉率測定弱，但在中值之后，故判定為弱）。所有參試19份耐鹽堿極強(qiáng)2份，占10.5%；強(qiáng)7份，占36.8%；中6份，占31.6%；弱3份，占15.8%；極弱1份，占5.3%。其中長白9號、白2029具有極強(qiáng)耐鹽堿性；白粳1號、白稻6、長白10號、0506、0529、0997、0541，具有強(qiáng)的耐鹽堿性；農(nóng)大10、通790、通育313、綏粳4、0590、0552，具有中等強(qiáng)度的耐鹽堿性； 0530、0561、0569，具有較弱的耐鹽堿性；0592的耐鹽堿性很差。

參考文獻(xiàn)

[1] 吉林省鹽堿地生態(tài)經(jīng)濟(jì)發(fā)展十一五規(guī)劃.

[2] 王參.根據(jù)吉林西部鹽堿土的成因來創(chuàng)新鹽堿地改良模式[J].吉林農(nóng)業(yè)，2012（12）

[3] 時(shí)東方， 趙驥民.吉林省西部地區(qū)鹽堿地土壤成分研究[J].貴州：貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010年（8）.

[4] 隋朋舉.吉林省西部水稻耐鹽堿品種篩選試驗(yàn)報(bào)告[J].北方水稻，2010年 （2）.

簡歷篩選范文第4篇

據(jù)國外調(diào)查統(tǒng)計(jì)，先天性聽力缺失的發(fā)病率在新生兒中占0.1%～0.3%。換言之，即新生兒聽力損失相對而言畢竟是少數(shù)。在對新生兒進(jìn)行大規(guī)模聽力篩查時(shí)注意盡量避免假陽性非常重要。故從理論上說，新生兒聽力篩查選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間進(jìn)行是非常必要的，可減少假陽性的出現(xiàn)，減少家長的疑慮。

1 篩查對象與方法

1.1篩查對象

2009年9月5日～10月5日在我院分娩或剖宮產(chǎn)的正常新生兒180例，分為3組（A組為出生后24小時(shí)，B組為出生后48小時(shí)，C組為出生后72小時(shí)～7天）。每組60例，3組新生兒阿氏評分、體重、性別無組間差異，C組新生兒剖宮產(chǎn)率較高，住院時(shí)間相對較長。

1.2方法

1.2.1篩查儀器 GSI.70自動耳聲發(fā)射聽力篩查儀。耳聲發(fā)射是聽力正常耳朵的耳蝸內(nèi)部產(chǎn)生的聲音，是外毛細(xì)胞內(nèi)部的一種生物力學(xué)過程。由于正常耳能產(chǎn)生耳聲發(fā)射，故耳聲發(fā)射不存在就成為耳蝸功能異常的一個(gè)可靠標(biāo)志。耳聲發(fā)射測試是對耳蝸進(jìn)行病理檢查的測試方法，快速、無損傷。

1.2.2 測試時(shí)間與結(jié)果判斷 每天上午10∶00～11∶30測試。雙耳pass為通過，一耳pass為不通過。A、B兩組未通過者，次日再復(fù)篩一次。于嬰兒30～90天之間全部復(fù)篩一次，保證復(fù)查的準(zhǔn)確性。如復(fù)篩未通過的嬰兒則應(yīng)及時(shí)進(jìn)行診斷性確診，建議去耳科觀察耳道是否有阻塞，檢測腦干誘發(fā)電位以查出病因。力爭在6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行干預(yù)，因?yàn)槁犃p傷的患兒在6個(gè)月之內(nèi)進(jìn)行干預(yù)可獲得與其發(fā)育年齡相當(dāng)?shù)难哉Z能力。這樣的時(shí)間安排，既有利于嬰兒的家庭，又節(jié)省了醫(yī)院的人力物力，且不耽擱嬰兒聽力損傷的早期干預(yù)。

1.2.3 測試位置 嬰兒側(cè)臥，被測耳朝上，輕輕地將耳廓向后下牽拉使耳道變直，將探頭輕輕放入，探頭與耳壁之間要封閉嚴(yán)。如果一側(cè)耳廓受壓，應(yīng)先測試不受壓的一次，也可將嬰兒抱在懷中測試。

1.2.4 注意衛(wèi)生 測試前要洗手，耳塞應(yīng)一人一塞，用75%酒精集中消毒后備用。外耳道如有盯聹，用消毒棉簽輕輕挖出，以免影響測試結(jié)果。

2 結(jié)果

隨著新生兒年齡的增長，耳聲發(fā)射篩查通過率逐漸增加。A組通過率52.3%，B組通過率73.8%，C組通過率85.7%。通過比較可以看出，B組與A組間差異有顯著性，C組與A組間差異有高度顯著性，B組與C組間差異有顯著性。

3 討論

3.1新生兒聽力測試的適宜時(shí)間 測試結(jié)果表明，出生后24小時(shí)進(jìn)行測試成功率較低（也就是假陽性發(fā)生率較高），宜在出生后72小時(shí)進(jìn)行。本文復(fù)篩180例，通過率為94%，10例測試未通過，經(jīng)耳鼻喉科進(jìn)一步檢查或腦干誘發(fā)電位檢測，其中中耳深部有分泌物阻塞5例，另5例結(jié)果不詳。目前認(rèn)為，中耳積液、羊水分泌物阻塞等使中耳傳音障礙，可能是造成假陽性的主要原因。會陰側(cè)切及剖宮產(chǎn)的嬰兒，可在48～72小時(shí)后進(jìn)行測試，通過率高。主要原因是隨著時(shí)間的延長，干擾因素逐漸減少。所以，住院期間的新生兒最好在48～72小時(shí)做聽力篩查。

3.2減少對產(chǎn)婦的精神刺激 如果耳聲發(fā)射不通過會給產(chǎn)婦增加負(fù)面影響，增加產(chǎn)婦的精神負(fù)擔(dān)。因此，在通過率高的時(shí)間測試，可減少假陽性的發(fā)生，有利于產(chǎn)婦的產(chǎn)后恢復(fù)。

3.3提高測試人員的工作效率 如果初次測試不通過，必須反復(fù)測試，這樣，既增加工作量，又浪費(fèi)大量時(shí)間。因此，選擇在48小時(shí)或72小時(shí)后篩查可明顯提高工作效率。

新生兒聽力篩查已納入婦幼保健的常規(guī)檢查項(xiàng)目，因此，選擇最佳的測試時(shí)間有重要的臨床意義，能早發(fā)現(xiàn)異常、早治療，以便取得良好的治療效果。目前，進(jìn)行聽力篩查的單位，對聽力篩查的時(shí)機(jī)大多數(shù)選擇在從新生兒出生到出院前，而新生兒住院時(shí)間往往很短，尤其是順產(chǎn)的嬰兒，大多在24～48h內(nèi)即出院。考慮到家屬對新生兒聽力篩查的依從性，臨床力爭在住院期間完成。在住院期間醫(yī)護(hù)人員對家屬做耐心細(xì)致的工作，嬰兒家屬基本可以接受新生兒聽力篩查。而出院后，相當(dāng)一部分家長并不重視回院復(fù)篩，主要是對此工作的意義不了解、嫌麻煩。針對這種情況，可采用下列措施進(jìn)行解決：①加大宣傳力度：加強(qiáng)優(yōu)生優(yōu)育宣傳，通過孕婦學(xué)校、板報(bào)、小冊子、多媒體等多種形式廣泛宣傳新生兒聽力篩查是國家法律法規(guī)，是提高出生人口素質(zhì)，減少出生缺陷的有效措施，是父母的義務(wù)和責(zé)任，以提高家人對嬰兒聽力篩查的認(rèn)識。②建立篩查網(wǎng)絡(luò)：其實(shí)，新生兒聽力篩查的技術(shù)難度并不大，只要有設(shè)備，對人員進(jìn)行短期培訓(xùn)，就可開展這項(xiàng)工作。建立多個(gè)平臺，使嬰兒聽力篩查工作非常便捷。如在醫(yī)院開展這項(xiàng)工作、在婦幼保健機(jī)構(gòu)開展這項(xiàng)工作、在社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心開展這項(xiàng)工作，以提高新生兒聽力篩查率。

參 考 文 獻(xiàn)

簡歷篩選范文第5篇

關(guān)鍵詞：核糖體展示；體外篩選；功能性蛋白；錨蛋白；紅血球膜帶3蛋白

中圖分類號：Q781

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007―7847(2006)01―0028―06

核糖體展示是一種體外篩選功能性蛋白質(zhì)的 有力的工具。首先，Mattheakis等人建立了一種用 于能夠展示和篩選肽的體外系統(tǒng)，隨后由Hanes 和Pluckthun等人正式建立了這種功能性蛋白體 外篩選技術(shù)。迄今為止，這一技術(shù)已經(jīng)被成功地 應(yīng)用于體外篩選與靶分子有親和能力的功能性分 子的相關(guān)領(lǐng)域。與其他的體內(nèi)蛋白質(zhì)篩選系統(tǒng) 不同的是，核糖體展示庫的建立不需要細(xì)菌轉(zhuǎn)化步 驟，其展示庫的多樣性能夠得到充分保留。

在特定的反應(yīng)條件下，蛋白質(zhì)基因型和表型 可以通過mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聯(lián)體復(fù)合物 的形式聯(lián)系起來．構(gòu)建的核糖體展示DNA庫中， 可能包含有編碼靶蛋白例如功能性蛋白的DNA 分子。DNA庫在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后的mRNA 純化后可用于體外翻譯，由于構(gòu)建的mRNA分 子缺乏終止子，核糖體會與mRNA的末端保持結(jié) 合狀態(tài)從而形成mRNA-核糖體，蛋白質(zhì)三聯(lián)復(fù) 合物，在高濃度鎂離子和低溫條件下該復(fù)合物非 常穩(wěn)定。通過親和結(jié)合作用，利用固定在固相或 溶液中的配體，能夠篩選出與其具有結(jié)合能力的 復(fù)合物。加入EDTA后，可以將結(jié)合下來的復(fù)合 物的mRNA洗脫下來．洗脫下來的mRNA經(jīng)過 純化可以用作RT-PCR從而恢復(fù)其基因型。逆 轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物也可以用于下一輪核糖體展示。 整個(gè)核糖體展示過程參照圖1。

紅血球膜帶3蛋白占人紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的 25％，是豐度最高的蛋白質(zhì)，它主要包括兩個(gè)結(jié) 構(gòu)域：跨膜區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。紅血球膜帶3蛋 白的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域是膜相關(guān)蛋白的錨定位點(diǎn)。錨蛋 白就是其中一種能夠與膜帶3蛋白緊密相連的外 周蛋白。我們利用這一對能夠緊密結(jié)合的蛋白 質(zhì)分子以驗(yàn)證核糖體展示技術(shù)的正確建立。

在核糖體展示技術(shù)中，體外轉(zhuǎn)錄和翻譯通常 是分開進(jìn)行的，在我們的這篇報(bào)道中利用體外轉(zhuǎn) 錄翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)，使DNA庫的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯同 時(shí)進(jìn)行，從而更加方便和快捷地完成核糖體展示 技術(shù)。

1 材料和方法

1，1 構(gòu)建用于核糖體展示的錨蛋白基因

用于核糖體展示的錨蛋白的構(gòu)建由組裝PCR 完成。其DNA分子模板包括一個(gè)T7啟動子，轉(zhuǎn) 錄后的RNA分子包括一個(gè)5＇―和3＇－的莖環(huán)結(jié) 構(gòu)，一個(gè)原核核糖體結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)lag-tag標(biāo)記的錨 蛋白基因不含終止密碼子，其C末端含有一段作 為間隔子的基因序列(圖2A)。

在第一步中，用引物1和引物2從周建忠博 上饋贈的含有cdb3的pGEX-2T質(zhì)粒中擴(kuò)增錨蛋 白基因。在第二步中，利用引物3和引物4從 AndreasPlOckthun教授饋贈的PAK200質(zhì)粒中擴(kuò) 噌噬菌體M13的羧基端作間隔子，其作用是確保 新合成的蛋白質(zhì)與核糖體相連，并且能夠利用間 隔子隔出合適的空間以讓新合成的蛋白質(zhì)正確折 疊。將前兩次的PCR產(chǎn)物純化以等摩爾的比例 混合，使用引物4和引物5做連接PCB，將錨蛋白 基因和間隔子連接起來，在最后一步中，將上一 步的PCR產(chǎn)物用引物6和引物4進(jìn)行擴(kuò)增，引入 T7啟動子和5’-莖環(huán)結(jié)構(gòu)。擴(kuò)增步驟和引物序列 見圖2B。

1．2 將配體固定在微孔板的表面

400 ng的edb3溶于100μL的PBS中4℃ 過夜包被微孔板。包被的微孔板用PBS洗3次， 再用含5％(w／v)BSA和50 mg／LS.cerevisiae RNA(Sigma)的PBS封閉。另外，用含5％(w／v) BSA和50mg／LS．cerevisiaeRNA(Sigma)的PBS 封閉空白孔用作對照．微孔板用PBS洗5次，用 washing buffer WBT(50 mmol／L Tris-acetate pH 7．5，150 mmol／L NaCl，50 mmol／L magnesiumac－ etate，0，1％Tween-20)洗2次。所有的孔均用冰 預(yù)冷的washingbufferWBT填充滿置于冰上，在用 于親和選擇前至少放置20min。

1.3 體外轉(zhuǎn)錄和翻譯

體外轉(zhuǎn)錄和翻譯采用Invitrogen公司的Ex－ presswayTmPlusExpressionSystem，按操作手冊進(jìn) 行，201LL的IVPSPlus E．coliExtract，20μL的 2．5xIVPSPlus E．coliReactionBuffer，1μL的T7 EnzymeMix，1μL的75 mmol／Lmethionine，1μL 的200 μmol／LAnti-ssrAoligonucleotide，1μL的 PCRproduct，and 6μL的DNase／RNase-freewater 加入在2．OmL的EP管中，反應(yīng)溶液37℃保溫30 rain，用4倍體積的冰預(yù)冷的WBTH(50 mmol／L Tris-acetatepH 7．5，150 mmol／L NaCI，50 mmol／L magnesium acetate，0．1％Tween-20，2，5 g／L hep- arin，Sigma)終止反應(yīng)。在上清液中加入預(yù)冷的 1／5體積的含有10％(w／v)BSA的WBT。反應(yīng) 混合物在14000S，4t離心5 min后，將上清液 轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的冰預(yù)冷的EP管中。

1.4 核糖體復(fù)合物的親和篩選

把冰預(yù)冷的微孔板中的washingbuffer傾掉， 將翻譯混合物轉(zhuǎn)至cdb3和BSA包被的孔中．將 微孔板在冷室中輕搖l h．傾掉翻譯反應(yīng)液，微孔 板用WBT洗5次，隨后，在孔中加入200 gL冰 預(yù)冷的elutionbufferEB (50mmol／LTris-acetate pH 7．5，150 mmol／L NaCl，50 mg／LS．cerevisiae RNA，20mmol／LEDTA)，冰上輕搖5 min以洗脫 mRNA。洗脫下來的mRNA用RNeasy kit (Qiagen)進(jìn)行純化．純化后mRNA溶于40 p．L RNase-free I-120中，用RNase-free DNase進(jìn)行處 理，去掉反應(yīng)液中的DNA分子。純化的RNA作 為模板，用引物4和引物5作RT-PCR．PCR產(chǎn)物 可以用作下一輪循環(huán)，或者做TA克隆和測序，

2 結(jié)果和討論

2.1 構(gòu)建用于核糖體展示的錨蛋白基因

圖3表示為構(gòu)建核糖體展示的錨蛋白基因過 程中每一輪的PCR產(chǎn)物。在第一輪PCR中我們 用上游引物1和下游引物2擴(kuò)增錨蛋白。引物2 與引物3的部分序列互補(bǔ)。引物3和引物4擴(kuò)增 絲狀噬菌體M13的基因重作為核糖體展示結(jié)構(gòu) 的間隔子。其作用是確保新合成的蛋白質(zhì)與核糖 體相連，并且能夠留出合適的空間讓新合成的蛋 白質(zhì)正確折疊與固定在微孔板上的肽相互作用， 通過引物5和引物6作PCR在核糖體展示結(jié)構(gòu) 引入體外轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的啟動子和核糖體 結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)中的5’-莖環(huán)結(jié)構(gòu)和3’－莖環(huán)結(jié) 構(gòu)對于mRNA分子的穩(wěn)定性及其抗RNase作用 非常重要。5’莖環(huán)結(jié)構(gòu)來源于噬菌體的基因 10，由引物5和引物6引入。3’-莖環(huán)結(jié)構(gòu)來源于 噬菌體T3的早期翻譯終止子，由引物4引入。

2．2 將配體固定在微孔板的表面

為了避免核糖體展示中的假陽性結(jié)果，充分 封閉微孔是十分重要的。我們曾經(jīng)用只含有5％ (w／v)BSA的PBS對微孔板進(jìn)行包被，結(jié)果出現(xiàn) 假陽性結(jié)果，當(dāng)我們改用含有5％(w／V)BSA和 50 mg／LS，cerevisiae RNA的PBS進(jìn)行包被時(shí)， 這一問題得到解決，我們用cdb3包被微孔板的5 個(gè)孔，同時(shí)另外5個(gè)孔用BSA進(jìn)行包被作為對照。 如果核糖體展示能夠正確工作，只能夠從cdb3包 被孔中的轉(zhuǎn)錄翻譯混合物中擴(kuò)增出錨蛋白基因。

2．3 體外轉(zhuǎn)錄和翻譯

核糖體展示技術(shù)中，轉(zhuǎn)錄和翻譯可以偶聯(lián)進(jìn) 行，也可以單獨(dú)進(jìn)行。由于T7 RNA聚合酶需要 還原劑保持其穩(wěn)定性，所以Schaffitzel etal，建議 當(dāng)核糖體展示用于含有二硫鍵的蛋白，轉(zhuǎn)錄和翻 譯應(yīng)該分開單獨(dú)進(jìn)行。但Coia etat應(yīng)用體外 轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解系統(tǒng)，通過 加入氧化型谷胱甘肽能夠展示含有二硫鍵的單鏈 抗體。同時(shí)可以利用真核生物二硫鍵別構(gòu)酶提 高含二硫鍵的蛋白質(zhì)的正確折疊率。由于錨蛋白 是一種不含二硫鍵的蛋白質(zhì)分子，所以我們在采 用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)中沒有采取以上兩種 措施。

在大腸桿菌中，如果mRNA不含終止密碼的 話，新合成的蛋白質(zhì)會被標(biāo)記上一種11個(gè)氨基酸 的肽標(biāo)簽。這一小肽由10SRNA編碼，是ssrA基 因產(chǎn)物。胞質(zhì)和外周胞質(zhì)中的羧基端蛋白酶會降 解加上這一肽標(biāo)簽的新生肽。所以為了避免展示 系統(tǒng)中新合成的肽被降解掉，我們在轉(zhuǎn)錄和翻譯 系統(tǒng)中加入了ssrA的反義寡核苷酸。

2．4 核糖體復(fù)合物的親和篩選

我們加了0．5μgPCR產(chǎn)物DNA分子到轉(zhuǎn)錄 翻譯反應(yīng)液中，翻譯完畢以后，將反應(yīng)溶液稀釋 至DNA濃度為0．25、0．05、0．025、0．002 5μg用 于親和篩選。通過在冰上冷卻并且用4倍體積的 WBTH稀釋終止蛋白翻譯，WBTH中含有的50 mmol／L乙酸鎂進(jìn)一步穩(wěn)定核糖體復(fù)合物．我們 將翻譯混合物分別加人到5個(gè)cdb3包被和BSA 包被的微孔中。由新合成的錨蛋白，核糖體和 mRNA組成的三聯(lián)復(fù)合物會與固相的cdb3蛋白 結(jié)合，洗滌掉沒有結(jié)合的三聯(lián)復(fù)合物以后，用elu－ tionbufferEB對mRNA洗脫，RNA純化后用引物 4和引物5做RT-PCR。擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物具 有我們預(yù)期的相對分子質(zhì)量，進(jìn)行TA克隆并測 序。多個(gè)克隆的測序結(jié)果證實(shí)RT-PCR產(chǎn)物是錨 蛋白(圖4)。相反的是，從BSA包被的孔里不能擴(kuò) 增出相應(yīng)的條帶(圖5)。圖4和圖5結(jié)果顯示：我們 只能從cdb3包被孔中的轉(zhuǎn)錄翻譯混合物中擴(kuò)增 出錨蛋白基因，而不能從BSA包被的孔中擴(kuò)增出 錨蛋白基因證明了核糖體展示技術(shù)的可行性。

從圖4和圖5可以看出，只有利用和錨蛋白 有親和能力的cdb3才能從轉(zhuǎn)錄翻譯混合物中親 和篩選得到錨蛋白基因，利用對照BSA并不能親 和篩選得到錨蛋白，說明我們建立的核糖體展示 技術(shù)能夠正常發(fā)揮作用。