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本文作者：付輝1孟瑤1梁紅1董義興1程方志1郝偉1朱逸格1高大文1,2作者單位：1.東北林業(yè)大學(xué)2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)

原油是一種比較復(fù)雜的混合物，不同地域的原油其成分也有較大的差異，不同環(huán)境自然凈化過程也有所不同，一般都比較緩慢［1］。在土壤修復(fù)過程中，生物修復(fù)操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)成為原油污染治理方法的主流［2－4］。由于不同的微生物對(duì)不同的成分降解效果不同，因此利用混合菌群的協(xié)同作用會(huì)起到更好的效果［5］。Komukai-Nakamura等［6］使用復(fù)合菌株對(duì)原油進(jìn)行降解研究，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌劑的降解效果明顯高于單一菌株。但目前所篩選的原油降解微生物絕大多數(shù)是細(xì)菌與酵母菌［7］，由于這類微生物必須有一定濃度的污染物才可能誘導(dǎo)合成所需的酶，對(duì)不良環(huán)境適應(yīng)性差且不易保存，因而不易在原油污染現(xiàn)場(chǎng)使用。白腐真菌由于其獨(dú)特的非專一性降解有機(jī)污染物的特點(diǎn)，而越來越受到國內(nèi)外研究者的重視，但目前針對(duì)白腐真菌的研究大都是研究單一白腐真菌對(duì)污染物的降解。本實(shí)驗(yàn)是在前期研究篩選出的最佳協(xié)同作用的復(fù)合菌株基礎(chǔ)上，研究復(fù)合菌劑對(duì)人工模擬污染土壤中原油降解效果。因此本研究為開發(fā)和利用我國東北土著白腐真菌治理原油污染土壤提供可靠的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種來源

本試驗(yàn)所用微生物菌由實(shí)驗(yàn)得出的3種高效復(fù)合菌株:青頂擬多孔菌、糙皮側(cè)耳菌和偏腫擬栓菌。

1.1.2主要培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，KH2PO43.0g/L，MgSO41.5g/L，定容至1L，自然pH(用于白腐真菌的擴(kuò)大培養(yǎng))。液體培養(yǎng)基:麩皮20g/L，氯化銨0.44g/L，KH2PO40.2g/L，MgSO40.05g/L，CaCl20.01g/L，吐溫801.0g/L，無機(jī)溶液1mL/L，維生素溶液0.5mL/L，自然pH。

1.1.3主要試劑

試劑:取自大慶原油油田的原油、93#汽油。儀器:SPX－150B型生化恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、SW－CJ－1D型單人凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、752型紫外－可見光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)、MSX－280型手提式壓力蒸汽消毒器(北京市永光日月醫(yī)療儀器廠)、HZQ－X100振蕩培養(yǎng)箱(中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)、電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.1.4原油污染土壤

實(shí)驗(yàn)用土為人工配制的原油污染土壤，土壤采集于東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)，原油由大慶油田提供。配置得到4.8%的原油污染土壤。

1.1.5菌劑制備

采用液體培養(yǎng)基，在28℃、120r/min條件下，搖床培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期(第9d)，將載體裝入瓶中進(jìn)行高壓滅菌，冷卻至室溫，將混合菌絲團(tuán)吸附于載體上制備成菌劑。

1.2測(cè)定方法

1.2.1土壤中含油量測(cè)定

土壤中含油量按紫外分光光計(jì)法［8］測(cè)定。

1.2.3土壤中pH值的測(cè)定

稱取混勻后的土壤樣品5g與25mL煮沸放涼的去離子水溶液攪拌混勻，放置1h，以PHS－2型酸度計(jì)測(cè)定pH值。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

菌劑的接種量分別為1g、2g、3g。加水量為每10d添加50mL蒸餾水。

2結(jié)果與分析

2.1不同接種量對(duì)原油的降解研究

微生物對(duì)原油污染物代謝的生理過程一般通過接觸并吸附原油，同時(shí)微生物分泌胞外酶通過氧化酶對(duì)原油的氧化降解［9］。原油污染物的吸收及胞內(nèi)代謝與地質(zhì)環(huán)境相結(jié)合完成。以微觀效應(yīng)改變宏觀環(huán)境，利用微生物和地質(zhì)環(huán)境相結(jié)合、相互作用、相互依存和調(diào)控等進(jìn)行進(jìn)一步改善。在定期添加蒸餾水的條件下，向污染土壤分別接種含有菌絲1g、2g和3g的復(fù)合菌劑，定期測(cè)定石油的降解率。從圖1可以看出，第20d的降解率分別為26.86%、32.34%和33.43%，第40d的降解率分別為34.90%、37.42%和38.18%，第100d降解率分別為41.86%、42.37%和43.00%;由于微生物菌劑投加越多，微生物分泌氧化酶越多，因此投加含有菌絲3g的復(fù)合菌劑對(duì)原油的降解效果最好，所以微生物的數(shù)量同樣是影響原油降解效率的重要因素［10－11］。

2.2土壤濕度對(duì)原油殘余量的影響

2.2.1添加蒸餾水條件下復(fù)合菌劑降解效果

微生物的生長(zhǎng)、胞外酶的分泌是降解污染土壤的關(guān)鍵。研究證實(shí)微生物的生命活性很大程度上依賴于環(huán)境中的水分和氧氣［12－13］。向污染土壤中投加含有菌絲3g的復(fù)合菌劑，每隔10d添加蒸餾水50mL，定期測(cè)定原油殘余量。由表1可以看出到第20d原油殘余量明顯下降，隨之變化不大，這與郭超［14］研究的結(jié)論相似。在添加蒸餾水的情況下，初始的原油含量為49.565g/kg，隨著菌劑的加入，前20d原油減少了16.571g/kg，前40d原油減少了18.925g/kg，前100d原油減少了21.316g/kg，可見前20d的原油快速降解，隨著時(shí)間的增加，石油的降解速率逐漸降低。隨著水分的蒸發(fā)、微生物的利用，水分的含量成明顯的下降趨勢(shì)，在第20d之前，復(fù)合菌劑降解效率好，對(duì)原油的去除起到了明顯的效果，隨之活性降低，去除效果緩慢。

2.2.2不加蒸餾水條件下復(fù)合菌劑降解效果

向污染土壤中投加含有菌絲3g的復(fù)合菌劑，在不添加蒸餾水的情況下，定期測(cè)定原油殘余量，原油殘余量見表1.可以看出到20d原油減少了7.809g/kg，到第40d原油減少了15.79g/kg，到100d原油減少了18.823g/kg。隨著土壤中原有的水分被吸收利用，在不添加任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的情況下，前20d降解效果顯著。由表1可見在不添加蒸餾水的情況下，前15d水分流失很快，直到第20d水分流失才出現(xiàn)緩慢趨勢(shì)，導(dǎo)致微生物菌劑出現(xiàn)或者延長(zhǎng)了適應(yīng)期的時(shí)間，隨著水分的蒸發(fā)、菌絲的吸收利用，總體看出菌絲越多，含水率越低，由于青頂擬多孔菌+糙皮側(cè)耳菌+偏腫擬栓菌的復(fù)合菌生長(zhǎng)中存在一定的適應(yīng)期，在營(yíng)養(yǎng)不充足的環(huán)境下，適應(yīng)期會(huì)有所延長(zhǎng)，隨著時(shí)間的增加，本身含有的水分也在揮發(fā)和被競(jìng)爭(zhēng)利用中消耗，得出水含量的多少對(duì)微生物分泌胞外酶去除污染物起到一定的作用。

2.2.3不同土壤水分下復(fù)合菌劑降解效果比較分析

對(duì)照表1可知，在相同的時(shí)間內(nèi)，添加蒸餾水比不添加蒸餾水原油殘余量低，到第100d時(shí)石油的殘余量添加蒸餾水比不添加蒸餾水減少了2.493g/kg，可見保持一定的土壤濕度有利于復(fù)合菌劑對(duì)石油的降解。由于添加水能提高氧的含量，氧含量的多少直接影響微生物細(xì)胞內(nèi)酶的活性和呼吸作用，控制著微生物的生長(zhǎng)和對(duì)原油烴類物質(zhì)的去除能力，間斷性的翻耕土壤也能使空氣進(jìn)入土壤，增加土壤的含氧量，使得添加蒸餾水比不添加蒸餾水的原油殘余量低;定期添加蒸餾水比不添加蒸餾水相對(duì)穩(wěn)定，更加體現(xiàn)了增加水分和含氧量可以促使微生物分泌胞外酶，加快污染物的去除。

2.3修復(fù)過程中pH值的變化對(duì)原油污染土壤的研究

微生物在降解原油污染物的過程中，產(chǎn)生一定量的有機(jī)酸加快對(duì)原油的降解效果，然而過酸的環(huán)境也會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，最佳的pH環(huán)境利于微生物更好的發(fā)揮效果，一般認(rèn)為pH值在6～8之間原油烴的降解效率最高［15－16］。向污染土壤中投加復(fù)合菌劑3g，在定期添加蒸餾水的污染土壤中測(cè)定酸堿度，結(jié)果如圖2所示，最初的污染土壤的pH值為5.73，隨著微生物菌劑的作用，pH值有所上升，在第20d時(shí)pH值為5.77，第100d時(shí)pH值為6.23，可見pH增加緩慢，隨著菌劑的增多，pH值也有所增加，田苗［17］也證實(shí)了在微生物的不斷作用下，土壤的pH值降低之后會(huì)有所增加。酸堿度持續(xù)在5～7之間，不會(huì)使酶的空間結(jié)構(gòu)改變，更不會(huì)引起酶的活性喪失，完全有利于微生物的生長(zhǎng)。

3結(jié)論

該復(fù)合菌劑降解效果十分明顯，在定期投加蒸餾水的條件下，投加的菌劑越多，降解效果越好，投加含有菌絲3g的菌劑第20d的降解率33.43%和第100d的43%，高于1g菌劑第20d的降解率26.86%和第100d的41.86%。添加蒸餾水對(duì)原油的去除率最為明顯，之后緩慢進(jìn)行;在定期投加蒸餾水的情況下，投加含有菌絲3g的菌劑，前20d原油殘余量減少了16.571g/kg，比不加蒸餾水的多了8.762g/kg。最初污染土壤的pH值為5.73，隨著復(fù)合微生物菌劑的作用，相同環(huán)境下菌劑越多，pH值越高。在100d的實(shí)驗(yàn)中pH一直在5.8～6.2之間，屬于微酸性環(huán)境，此環(huán)境利于微生物生長(zhǎng)。