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一、CsupOBP1與不同氣味化合物的結(jié)合能力

熒光探針1-NPN和CsupOBP1的結(jié)合曲線(xiàn)。熒光強(qiáng)度隨加入1-NPN濃度的提高而增強(qiáng)，求得兩者間的結(jié)合常數(shù)為10．93μmol/L。以1-NPN為探針，利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定了38種不同化合物與CsupOBP1的結(jié)合能力(圖5:B～H)。結(jié)果顯示，在被測(cè)化合物中，只有β-紫羅蘭酮與CsupOBP1的結(jié)合能力最強(qiáng)，結(jié)合常數(shù)達(dá)9．53μmol/L，其他化合物的結(jié)合能力均較差。其中，在測(cè)定CsupOBP1與烷烴類(lèi)和脂肪酸類(lèi)化合物的結(jié)合能力時(shí)，隨配體濃度的提高熒光強(qiáng)度反而上升，表明CsupOBP1與脂肪酸無(wú)結(jié)合能力。

二、二化螟成蟲(chóng)對(duì)不同植物氣味的觸角電位反應(yīng)

根據(jù)體外配體結(jié)合能力的測(cè)定結(jié)果，選取β-紫羅蘭酮等4種與CsupOBP1具有較強(qiáng)結(jié)合能力的植物氣味進(jìn)行了觸角電位反應(yīng)測(cè)定。結(jié)果表明，雌雄成蟲(chóng)對(duì)被測(cè)氣味［雄蟲(chóng)對(duì)(+)-雪松醇除外］均可產(chǎn)生顯著的EAG反應(yīng)。4種氣味相比較，雄蟲(chóng)對(duì)β-紫羅蘭酮產(chǎn)生的反應(yīng)顯著強(qiáng)于其他3種化合物，但在雌蟲(chóng)中4種氣味間沒(méi)有顯著差異。另外，雄蟲(chóng)對(duì)β-紫羅蘭酮的EAG反應(yīng)明顯強(qiáng)于雌蟲(chóng)的反應(yīng)(5．86mV)，兩者相差近1倍。

三、討論

本研究從二化螟克隆了一個(gè)非典型的OBP基因CsupOBP1，同時(shí)也是在二化螟中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Minus-COBP，說(shuō)明了二化螟中OBP種類(lèi)的多樣性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，CsupOBP1和另外8個(gè)Minus-COBP形成一個(gè)獨(dú)立的分支，它們分別來(lái)源于家蠶(5個(gè))、棉鈴蟲(chóng)(2個(gè))和煙芽夜蛾(1個(gè))。前人對(duì)不同昆蟲(chóng)基因組序列所含OBP的比較發(fā)現(xiàn)，Minus-COBP更多存在于較原始的昆蟲(chóng)中，而Plus-COBP則更多存在于進(jìn)化的物種中，因此推測(cè)ClassicOBP(典型OBP)和Plus-COBP起源于。鑒于半胱氨酸(Cystein)位點(diǎn)間可以形成二硫鍵，且二硫鍵在高級(jí)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定上起重要作用，OBP向著產(chǎn)生更多二硫鍵的方向進(jìn)化，可能使OBP的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，以適應(yīng)對(duì)特殊氣味物質(zhì)的嗅覺(jué)需求。組織表達(dá)譜分析及雌雄差異比較是了解基因功能的基本途經(jīng)。利用RT-qPCR技術(shù)的測(cè)定結(jié)果表明，CsupOBP1在二化螟幼蟲(chóng)期的表達(dá)量遠(yuǎn)高于成蟲(chóng)期，表明該基因在幼蟲(chóng)期可能起到更為重要的作用;而在幼蟲(chóng)頭部的表達(dá)量是其他部位的2倍以上，鑒于頭部作為嗅覺(jué)和味覺(jué)的中心，暗示該基因在幼蟲(chóng)的嗅覺(jué)和味覺(jué)中起作用。類(lèi)似地，家蠶OBP23基因在成蟲(chóng)期的表達(dá)量也明顯低于幼蟲(chóng)期。在成蟲(chóng)期，CsupOBP1在足和翅的表達(dá)量最高。除觸角外，很多昆蟲(chóng)的足和翅上也分布有一些味覺(jué)及嗅覺(jué)感器，行使特定的化感功能，如一些鱗翅目昆蟲(chóng)的前足跗節(jié)上著生有化感器，用于感受同種雌蟲(chóng)產(chǎn)卵時(shí)隨卵一起分泌到葉片上的抑卵信息素，從而調(diào)節(jié)同種雌蟲(chóng)在不同的葉片(或部位)產(chǎn)卵，避免后代對(duì)食物的過(guò)度競(jìng)爭(zhēng)。CsupOBP1在足和翅中的顯著高表達(dá)，其功能值得進(jìn)一步研究。此外，CsupOBP1在雄蟲(chóng)觸角中也具有較高的表達(dá)，但雌蟲(chóng)觸角的表達(dá)量卻很低，這意味著CsupOBP1在雄蛾的嗅覺(jué)中可能起到更為重要的作用。為了進(jìn)一步探討CsupOBP1的嗅覺(jué)功能，我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)和親和層析法對(duì)其進(jìn)行了大量表達(dá)和純化，然后體外測(cè)定了CsupOBP1與包括常見(jiàn)植物氣味在內(nèi)的38種化合物的結(jié)合能力。在結(jié)合試驗(yàn)中，一般認(rèn)為結(jié)合常數(shù)(Ki值)在10μmol/L以下時(shí)說(shuō)明配體和蛋白有較好的結(jié)合能力。而本研究所測(cè)配體中，只有β-紫羅蘭酮與CsupOBP1的結(jié)合能力低于這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。前人對(duì)棉鈴蟲(chóng)2個(gè)的研究也發(fā)現(xiàn)，2個(gè)OBP在被測(cè)的85種化合物中均以與β-紫羅蘭酮的結(jié)合能力最強(qiáng)，結(jié)合常數(shù)分別為。

四、結(jié)論

β-紫羅蘭酮作為一種香味組分，廣泛存在于包括水稻在內(nèi)的很多植物的花和其他組織中，而昆蟲(chóng)常常利用一些香味物質(zhì)對(duì)寄主植物進(jìn)行定位綜合組織表達(dá)譜及配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)CsupOBP1可能通過(guò)對(duì)植物氣味(特別是β-紫羅蘭酮)的感受，從而在二化螟幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)對(duì)寄主植物或組織的嗅覺(jué)定向中起作用。本文以成蟲(chóng)觸角進(jìn)行的觸角電位測(cè)定結(jié)果也與該推測(cè)一致，無(wú)論雌蟲(chóng)還是雄蟲(chóng)對(duì)β-紫羅蘭酮等幾種氣味物質(zhì)均可產(chǎn)生顯著的觸角電位反應(yīng)，而且雄蟲(chóng)對(duì)β-紫羅蘭酮的EAG反應(yīng)顯著強(qiáng)于其他3種氣味物質(zhì);此外，雄蟲(chóng)對(duì)β-紫羅蘭酮的EAG反應(yīng)2倍于雌蟲(chóng)的反應(yīng)，這與CsupOBP1在雄蟲(chóng)觸角內(nèi)的表達(dá)量顯著高于雌蟲(chóng)觸角的結(jié)果也是一致的，進(jìn)一步說(shuō)明CsupOBP1在雄蛾的嗅覺(jué)中可能起到更為重要的作用。最后要指出的是，本文通過(guò)組織表達(dá)特性、體外配體結(jié)合試驗(yàn)及觸角電生理測(cè)定，均間接說(shuō)明CsupOBP1在二化螟對(duì)寄主植物氣味(特別是β-紫羅蘭酮)的嗅覺(jué)中起作用，但確定性的結(jié)論有待利用基因沉默等技術(shù)進(jìn)一步研究。

作者：賈洪芳單位：北京科技大學(xué)