化學發(fā)光分析儀生物化學論文
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1實驗部分
（德國伯托公司）；白色96孔板（美國康寧公司）。魯米諾（Sigma-aldrich公司）；8-羥基喹啉（Sig－ma-aldrich公司）；FeCl3（Sigma-aldrich公司）；過氧化氫（30%，Sigma-aldrich公司）；ATP生物發(fā)光檢測試劑盒（ENLITEN，美國普洛麥格公司）；實驗用水均為經(jīng)Milli-Q（Millipore公司）純化的超純?nèi)ルx子水。實驗中所用試劑均為分析純。
1.2實驗方法
1.2.1儲備液的配制
魯米諾儲備溶液：稱取一定量的魯米諾溶于1mol/L的NaOH溶液中，配制成1×10-2mol/L的魯米諾儲備液，儲存在棕色瓶中，避光4℃保存。8-羥基喹啉儲備溶液：稱取一定量的8-羥基喹啉溶于0.1mol/L的HCl溶液中，配制成1×10-2mol/L的8-羥基喹啉儲備液，4℃保存。Fe（III）標準儲備溶液：稱取一定量的烘干恒重的FeCl3溶于pH2.5的HCl溶液中，配制成1×10-3mol/L的Fe（III）標準儲備溶液，其摩爾濃度通過硫代硫酸鈉滴定法準確確定，通過GBW(E)081235硫代硫酸鈉滴定溶液標準物質(zhì)進行溯源。ATP標準儲備溶液：稱取一定量的ATP標準物質(zhì)候選物溶于無ATP水（ATP生物發(fā)光檢測試劑盒自帶）中，配制成1×10-7mol/L的ATP標準儲備液，-20℃保存。作為實驗室研制的標準物質(zhì)候選物，需要按照ISO導則35要求，摩爾濃度經(jīng)過8家單位聯(lián)合驗證，并經(jīng)過一系列均勻性、穩(wěn)定性的考查。
1.2.2工作溶液的配制
魯米諾工作溶液：用純水將魯米諾儲備液稀釋成1×10-3mol/L的魯米諾工作溶液（其中NaOH的摩爾濃度為0.1mol/L）。8-羥基喹啉工作溶液：用純水將8-羥基喹啉儲備溶液稀釋成1×10-3mol/L的8-羥基喹啉工作液（其中HCl的摩爾濃度為0.01mol/L）。Fe（III）標準工作溶液：用pH2.5的HCl溶液將Fe（III）標準儲備溶液逐級稀釋成Fe（III）標準工作溶液（1×10-4mol/L，3×10-5mol/L，1×10-5mol/L，3×10-6mol/L，1×10-6mol/L）。過氧化氫溶液：取一定量體積分數(shù)為30%的過氧化氫，用水稀釋至1%，用時現(xiàn)配。ATP標準工作溶液：用檢測緩沖液（ATP生物發(fā)光檢測試劑盒自帶）將ATP標準儲備溶液逐級稀釋成ATP標準工作溶液（1×10-8mol/L，1×10-9mol/L、1×10-10mol/L，1×10-11mol/L），現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.2.3實驗方法
1）化學發(fā)光標準體系的建立
化學發(fā)光反應動力學檢測：在1.5mL離心管中分別依次加入以下溶液，立刻將該離心管放到化學發(fā)光分析儀中，進行動力學檢測，每秒取一個點，檢測時間共100s。①10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLpH2.5的HCl溶液（相當于10μLFe（III）標準工作溶液）、85μLpH2.0的HCl溶液（相當于85μL8-羥基喹啉工作溶液）；②10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）、85μLpH2.0的HCl溶液（相當于85μL8-羥基喹啉工作溶液）；③10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLpH2.5的HCl溶液（相當于10μLFe（III）標準工作溶液）、85μL8-羥基喹啉工作溶液；④10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液。8-羥基喹啉的用量對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響：在10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）中分別加入不同體積的8-羥基喹啉工作溶液，并用pH2.0的HCl溶液將體系補足205μL，立即檢測當前發(fā)光值。pH對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響：在1.5mL離心管中依次加入10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液，利用HCl或NaOH調(diào)整體系的pH值，立刻將該離心管放到化學發(fā)光分析儀中檢測當前發(fā)光值。反應介質(zhì)對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響：在1.5mL離心管中分別加入50μL的Tris-HCl、H3BO3-KOH、Na2CO3-NaHCO3和B-R緩沖溶液，然后分別依次加入10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液，立刻將該離心管放到化學發(fā)光分析儀中檢測當前發(fā)光值。
2）生物發(fā)光標準體系的建立
用ATP標準物質(zhì)代替ATP生物發(fā)光檢測試劑盒中的ATP校準溶液，采用試劑盒中的其他溶液建立生物發(fā)光標準體系：首先，將10μL檢測緩沖液加入有100μL熒光素/熒光素酶試劑的1.5mL離心管中，立刻將該離心管放到化學發(fā)光分析儀中進行檢測，作為背景信號；然后，將10μLATP標準工作溶液加入有100μL熒光素/熒光素酶試劑的1.5mL離心管中，立刻將該離心管放到化學發(fā)光分析儀中進行檢測。
2結果與討論
2.1化學發(fā)光標準體系的建立
魯米諾（3-氨基鄰苯二甲酰肼）是最常見的化學發(fā)光試劑之一，具有發(fā)光效率高、結構簡單、容易合成、水溶性好等優(yōu)點；在堿性條件下，魯米諾被氧化劑（如過氧化氫）氧化后能發(fā)出波長425nm的藍光。在不同體系中，魯米諾發(fā)光形式不同：金屬離子-過氧化氫-魯米諾體系是閃光型發(fā)光；辣根過氧化物酶（HRP）-過氧化氫-魯米諾體系[9-10]是輝光型發(fā)光。HRP-魯米諾體系雖是輝光型發(fā)光，但生物酶的活性很難控制和復現(xiàn)，不適用于儀器的計量校準。本文將8-羥基喹啉（8-Ox）引入魯米諾-過氧化氫-金屬離子體系中，實現(xiàn)發(fā)光方式由閃光型到輝光型的轉(zhuǎn)變，建立了發(fā)光強度穩(wěn)定的魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學發(fā)光標準體系。
2.1.1添加8-羥基喹啉
初步實現(xiàn)穩(wěn)定輝光型信號魯米諾在堿性溶液中，與OH-反應生成陰離子，該陰離子被某些氧化劑氧化產(chǎn)生氨基鄰苯二甲酸根離子，氧化過程中產(chǎn)生的化學能被氨基鄰苯二甲酸根離子吸收，使其處于激發(fā)態(tài)，回到基態(tài)時發(fā)出波長為425nm的光，F(xiàn)e（III）可以催化該反應過程，增強化學發(fā)光信號，而8-羥基喹啉可以與Fe（III）絡合，從而起到穩(wěn)定劑的作用。不同體系中魯米諾-H2O2的發(fā)光情況，其縱坐標為相對發(fā)光強度（RLU）。曲線a說明魯米諾與H2O2混合后，被H2O2氧化并發(fā)光，剛開始發(fā)光值緩慢上升，隨著反應物的消耗，發(fā)光值開始緩慢下降，發(fā)光形式呈現(xiàn)一個較平緩的閃光；曲線b說明在魯米諾-H2O2體系中加入了Fe（III）之后，加速了魯米諾與H2O2反應，因此一開始體系的發(fā)光就達到了最大值，之后隨著反應物的快速消耗，發(fā)光值也急速下降；曲線c說明當在這個體系中加入8-羥基喹啉，F(xiàn)e（III）與其絡合，保證了在堿性條件下Fe（III）的穩(wěn)定性，使化學發(fā)光反應變成非常平穩(wěn)的輝光型，在100s內(nèi)發(fā)光值的相對標準偏差僅為1.1%。曲線d是沒有Fe（III）的空白對照實驗。
2.1.2優(yōu)化反應體系的穩(wěn)定性
為獲得穩(wěn)定且容易操作的化學發(fā)光反應體系，選擇了10μL魯米諾工作溶液（摩爾濃度為1×10-3mol/L）和100μL過氧化氫溶液（體積分數(shù)濃度為1%）的基礎上，考察8-羥基喹啉的用量、反應體系最終pH和反應介質(zhì)3個方面的因素，最終確定了該化學發(fā)光體系優(yōu)化濃度比例。
1）8-羥基喹啉的用量對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響
隨著向體系中加入8-羥基喹啉工作溶液的增多，體系的發(fā)光值持續(xù)降低，直到當加入50μL8-羥基喹啉工作溶液，體系的發(fā)光值不再隨著8-羥基喹啉加入量的增加而降低。在儀器計量工作中，可以選擇加入50~85μL8-羥基喹啉工作溶液，此時8-羥基喹啉的體積對發(fā)光強度的影響最小。在后續(xù)實驗中，選擇65μL作為優(yōu)化的8-羥基喹啉加入量。
2）反應體系最終pH對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響
魯米諾的化學發(fā)光反應需要OH-的參與，因此體系的pH也是影響發(fā)光值的重要因素之一。當pH＞10.0，體系的發(fā)光值會隨著pH增大而呈指數(shù)增加，體系不容易控制；當pH值在8.80~9.60范圍內(nèi)，體系的發(fā)光值增長比較穩(wěn)定，可以滿足儀器計量檢定中操作方便的需求。
3）緩沖體系對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響
考察了相同濃度的Tris-HCl、H3BO3-KOH、Na2CO3-NaHCO3和B-R緩沖溶液對魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學發(fā)光體系的影響，發(fā)現(xiàn)Tris-HCl中化學發(fā)光信號最為穩(wěn)定，故選擇Tris-HCl緩沖溶液；最終體系定為：加入50μL0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液，pH=9.10。通過對8-羥基喹啉的用量、反應體系最終pH和反應介質(zhì)3個方面的考查，確定了化學發(fā)光分析儀計量用魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉體系，其用量分別為：10μL摩爾濃度為1×10-3mol/L魯米諾工作溶液（pH13.0）、100μL體積分數(shù)為1%過氧化氫溶液、65μL摩爾濃度為1×10-3mol/L8-羥基喹啉工作溶液（pH2.0）、和50μL0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH=9.10）。此時化學發(fā)光強度與Fe（III）的摩爾濃度具有很好的線性關系。
2.2生物發(fā)光標準體系的建立
在眾多生物發(fā)光體系中，ATP-熒光素-熒光素酶發(fā)光體系應用最為廣泛，ATP檢測也經(jīng)常被業(yè)內(nèi)用于化學發(fā)光分析儀靈敏度的衡量指標。其原理是：熒光素酶在有氧條件下，可以和熒光素結合后催化ATP轉(zhuǎn)化成AMP（磷酸腺苷），同時釋放出光子（波長562nm），發(fā)光效率高，而且發(fā)光強度與ATP含量呈很好的線性關系。為了統(tǒng)一儀器靈敏度的評價方法，我們研制了ATP標準物質(zhì)，并結合商品化ATP檢測試劑盒，建立了一套穩(wěn)定可靠的ATP生物發(fā)光標準體系，用于化學發(fā)光分析儀的計量校準。
2.3生物化學發(fā)光標準體系
在儀器計量校準中的應用最終將化學發(fā)光標準體系和生物發(fā)光標準體系聯(lián)合，共同對化學發(fā)光分析儀進行計量校準研究，對儀器的計量性能進行全面的考察：采用魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學發(fā)光標準體系對伯托LB962型化學發(fā)光分析儀的測量重復性、交叉污染和線性相關系數(shù)的計量特性進行評價；采用ATP生物發(fā)光標準體系作為標準光源對伯托LB962型化學發(fā)光分析儀的靈敏度的計量特性進行評價。
2.3.1測量重復性
以1×10-5mol/LFe（III）標準工作溶液進行測量，重復測量6次，相對發(fā)光強度值分別為302579，298800，321145，299523，338856，356041，計算其相對標準偏差為7.4%，即為儀器的測量重復性。實驗數(shù)據(jù)說明儀器測量重復性較好；同時也說明建立的化學發(fā)光標準反應體系發(fā)光值穩(wěn)定，完全可以用于儀器測量重復性的計量特性的評價。
2.3.2交叉污染測量中心孔
（樣品位置，1×10-5mol/LFe（III）標準工作溶液）發(fā)光值I0和周圍孔發(fā)光值I0i，如表1所示，周圍孔發(fā)光值的平均值與中心孔發(fā)光值之比的百分數(shù)即為化學發(fā)光分析儀的交叉污染。由實驗數(shù)據(jù)可以看出，中心孔的發(fā)光對周圍孔發(fā)光影響很小，儀器的交叉污染僅為0.02%，與儀器的出廠指標無明顯差異；同時證明了我們建立的化學發(fā)光標準反應體系可以用來評價儀器的交叉污染的計量特性。
2.3.3線性相關系
數(shù)采用化學發(fā)光標準體系對0，1×10-6，3×10-6，1×10-5，3×10-5，1×10-4mol/LFe（III）標準工作溶液進行測量，考察儀器測量線性相關系數(shù)，以檢測發(fā)光值信號減去本底信號得到的相對發(fā)光值ΔI為縱坐標（本底信號為Fe（III）摩爾濃度為0時的發(fā)光值），F(xiàn)e（III）的摩爾濃度為橫坐標繪制標準曲線，F(xiàn)e（III）在1×10-6~1×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系：ΔI=2×1010C-22396，線性相關系數(shù)r=0.9986。使用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒對0，1×10-11，1×10-10，1×10-9，1×10-8，1×10-7mol/LATP標準工作溶液進行分析，考察儀器測量線性相關系數(shù)，以相對發(fā)光值Δ（IΔI為檢測發(fā)光值信號減去本底信號，本底信號為ATP濃度為0時的發(fā)光值）為縱坐標，ATP的摩爾濃度為橫坐標繪制標準曲線。ATP在1×10-11~1×10-7mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系：ΔI=7×1012C+550，線性相關系數(shù)r=0.9999。采用化學發(fā)光標準反應體系和生物發(fā)光標準反應反應體系評價儀器的線性相關系數(shù)分別為0.9986和0.9999，說明儀器的線性相關系數(shù)的性能指標較好；這兩種反應體系均能評價儀器的線性相關系數(shù)的計量特性。
2.3.4靈敏度使用
ATP生物發(fā)光檢測試劑盒對空白溶液的本底信號進行測量，平行檢測11次，本底信號相對發(fā)光強度分別為29，34，32，34，40，47，37，42，34，39，32，計算檢出限（3×S/N）為2.24×10-16molATP（100μL樣品體積），即為化學發(fā)光分析儀的靈敏度，達到儀器的出廠指標，說明ATP生物發(fā)光標準反應體系可以用來評價儀器的靈敏度的計量特性，統(tǒng)一了化學發(fā)光分析儀靈敏度的表示方法。
3結束語
本文模擬化學發(fā)光分析儀的實際工作狀態(tài)，建立了可溯源的魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學發(fā)光標準體系和ATP-熒光素-熒光素酶生物發(fā)光標準體系，并將這兩種標準體系聯(lián)合，應用到化學發(fā)光分析儀的計量校準工作中，對儀器測量重復性、交叉污染、線性相關系數(shù)和靈敏度計量特性進行實驗研究，實現(xiàn)了對化學發(fā)光分析儀計量性能的全面考察，為化學發(fā)光分析儀日常的校準工作以及國家計量校準規(guī)范的制訂提供了實驗基礎。
作者：李蘭英徐勤許麗聞艷麗武利慶任淑貞劉剛單位：上海市計量測試技術研究院中國計量科學研究院
