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摘要：采取索氏抽提法、水提醇沉法、乙醇回流提取法、復(fù)合提取法從木瓜中提取多糖，經(jīng)過(guò)分離純化后，進(jìn)行IR鑒定。為木瓜多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：木瓜；多糖；提?。环蛛x；鑒定

0前言

多糖（polysacharides，PS），又稱多聚糖，是一種具有廣泛生物活性的大分子。從各種中草藥和其他植物中都可以提取分離出多糖，我國(guó)近年來(lái)對(duì)植物多糖，特別是具有中國(guó)特色的中草藥多糖的藥物活性已有廣泛報(bào)道。

木瓜原名番木瓜，始載于《名醫(yī)別錄》，屬薔薇科木瓜屬植物，是我國(guó)特有果木之一，主要生長(zhǎng)在亞熱帶溫暖濕潤(rùn)的山區(qū)地帶，是一種藥食同源的植物，性溫味酸。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明：木瓜果實(shí)中含有豐富的糖分、番木瓜堿、木瓜蛋白酶，并含有17種以上的氨基酸及多種微量元素。目前已有大量木瓜產(chǎn)品上市，如木瓜飲料、木瓜醋、木瓜奶、木瓜酒、木瓜干片、木瓜脯等，深受人們的喜愛(ài)。

湖北建始縣盛產(chǎn)木瓜，但是創(chuàng)收的途徑主要是通過(guò)銷售鮮木瓜或干木瓜，其他相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)并不多見(jiàn)。從木瓜中提取和分離鑒定具有保健和藥理活性的功能性成分，對(duì)于提高木瓜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，解決目前農(nóng)民木瓜豐產(chǎn)不豐收、大量木瓜急待加工開發(fā)的問(wèn)題具有積極的意義。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)木瓜中多糖進(jìn)行研究，擬對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)粗多糖進(jìn)行分離純化鑒定組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征，為進(jìn)一步提高木瓜的附加值提供試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

（1）原料：湖北省建始縣干木瓜片，粉碎機(jī)粉碎

（2）儀器：TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)，UV-7504紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，紫外掃描儀，付立葉變換紅外光譜儀，Prostar高效液相色譜儀等。

（3）試劑：石油醚（沸程60-90℃），丙酮，乙醇（95%），戊醇，三氯甲烷，氯化鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，硫酸，鹽酸，苯酚，葡萄糖，乙醚，三氟三氯乙烷，三氯醋酸，碘液，硫酸銅，酒石酸鉀鈉，D-半乳糖，溴化鉀，碳酸鋇。

1．2方法

（1）多糖的測(cè)定：用苯酚-硫酸法對(duì)多糖測(cè)定。

（2）多糖的提取：①不同提取多糖方法的比較。分別用索氏抽提法，水提醇沉法，乙醇回流提取法，復(fù)合提取法提取木瓜中的多糖，并比較多糖得率，選擇較好的水提醇沉法進(jìn)行優(yōu)化處理。

②水提醇沉法提取多糖工藝的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)

a溫度對(duì)提取率的影響：加水量為30ml，水提時(shí)間為30分鐘，分別在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃的水浴條件下，提取多糖，用苯酚-硫酸法測(cè)定其含量，

b加水量對(duì)提取率的影響：水浴溫度為90℃，水提時(shí)間為30分鐘的條件下，改變加水量，提取多糖，并采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定，

c水提時(shí)間對(duì)提取率的影響：水浴溫度為90℃，加水量為40ml的條件下，不同的水提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，

正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取合適的水平，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化處理。

（3）多糖的分離、純化。

①蛋白質(zhì)的去除：分別用Sevage法，三氟三氯乙烷法，三氯醋酸法去除樣品中的蛋白質(zhì)。

②低聚糖等小分子雜質(zhì)的去除：通過(guò)逆向流水透析除去低聚糖等小分子雜質(zhì)。

③多糖的柱層析純化：采用DEAE-52纖維素離子交換柱柱層析方法進(jìn)行。

依次用0.5mol／L的NaOH、HCl和蒸餾水處理填柱材料至中性，反復(fù)處理三次后用蒸餾水洗至中性，抽氣裝柱。用pH=7.6PBS溶液平衡48小時(shí)。稱取粗多糖1.0g，溶于少量蒸餾水中，離心除去不溶物，上清液過(guò)柱。用0.1-2.0mol／L的NaCl-PBS溶液梯度洗脫，控制流速為1ml／min，采用部分收集器按5ml／tub收集。以苯酚-硫酸法測(cè)吸光值（490nm）作洗脫曲線，根據(jù)吸光值將同一組分合并。

（4）多糖的鑒定。

①淀粉的碘反應(yīng)：將純化后的得到的多糖配制成5%的溶液，滴加碘液0.2ml，水浴加熱，觀察顏色是否有變化，同時(shí)做淀粉的對(duì)比試驗(yàn)。

②溶解性：稱取純化后的多糖0.5g，加入3ml的水，常溫下攪拌，觀察其溶解性。

③還原糖的測(cè)定：取0.1mg／ml的多糖溶液50ml于試管中，在80℃的恒溫水浴鍋中保溫30分鐘，吸取6ml，加入4ml的斐林試劑（等體積的斐林試劑A液和斐林試劑B液混合），于590nm處比色。

④蛋白質(zhì)的測(cè)定：將純化得到的多糖在190-400nm處進(jìn)行UV掃描，觀察在250-280nm處沒(méi)有吸收峰，判斷是否有核酸和蛋白質(zhì)的存在。

⑤IR鑒定多糖中糖苷鍵的類型：將多糖與溴化鉀烘干后，稱取多糖2mg與100mg的溴化鉀研磨，壓片，置于紅外圖譜分析儀中作紅外分析。

⑥HPLC鑒定多糖中單糖的組成：用高效液相色譜法對(duì)木瓜多糖的單糖組成進(jìn)行定性鑒定。

樣品的處理：稱取純化后的多糖10.0mg，加1mol／L的硫酸2ml，充N2后于100℃水浴加熱5h，用BaCO3中和，膜過(guò)濾后作為待測(cè)樣品。

標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取葡萄糖、半乳糖25mg，分別溶于5ml的蒸餾水中，配成5mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)液，膜過(guò)濾后待用。

色譜條件：以AglientZorbaxCarbohydrate(4.6×250㎜,5um)糖分析柱為固定相，80%的乙腈為流動(dòng)相，流速1.0mL／min，柱溫25℃。利用示差檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣量為20uL，分別對(duì)葡萄糖和半乳糖標(biāo)樣及樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2．1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

本研究采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2-1。

由上圖可知，回歸方程為y=0.0552x+0.0383，R2=0.9981。線性關(guān)系較好，可以以此來(lái)測(cè)定多糖的含量。

2．2多糖的提取

（1）不同提取多糖方法的比較。

對(duì)四種提取法方法進(jìn)行對(duì)比，由吸光值可得其相對(duì)得率，結(jié)果見(jiàn)圖2-2。

圖2-2不同提取方法提取率的比較

比較以上四種提取方法，本研究選定較好的水提醇沉淀法作為提取木瓜中多糖的方法，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化提取工藝。

（2）單因素實(shí)驗(yàn)。

①溫度對(duì)提取率的影響。

由圖2-3可以得到，在相同的加水量及水提時(shí)間的條件下，在90℃時(shí)多糖的得率較高，提取效果較好，分析其原因，可以知道，升溫有利于粗多糖得率提高，為獲得較高提取率，應(yīng)選擇較高溫度，但是溫度超過(guò)90℃時(shí)，不僅多糖的生物活性有可能遭到破壞，而且考慮到大幅度升溫會(huì)帶來(lái)能源消耗。綜合考慮效比，選擇85℃、90℃、95℃作為正交試驗(yàn)的因素水平。

②加水量對(duì)提取率的影響。

水浴溫度為90℃，水提時(shí)間為30分鐘的條件下，改變加水量，提取多糖，并采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2-4。

由圖2-4可以得到，在相同水浴溫度及水提時(shí)間的條件下，加水量為40ml時(shí)，多糖的得率相對(duì)較高，效果較好。在加水量為25ml或30ml時(shí)，由于水提的效果并不好，從而影響到醇沉效果，多糖的得率并不高，但加水過(guò)大，提取率反而下降，因此，加水量過(guò)少或過(guò)多均會(huì)造成多糖得率的降低?？梢赃x擇加水量30ml、45ml、60ml作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

③水提時(shí)間對(duì)提取率的影響。

水浴溫度為90℃，加水量為40ml的條件下，不同的水提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2-5。

由圖2-5可知，水提時(shí)間越長(zhǎng)，粗多糖的得率越高，當(dāng)時(shí)間超過(guò)30分鐘時(shí)，提取率增加量開始減少，在40分鐘時(shí)，提取率最大，考慮到能源消耗、生產(chǎn)周期延長(zhǎng)都會(huì)增加生產(chǎn)成本，水提時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，因此選擇15min、20min、30min作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。（3）正交結(jié)果。

極差的大小反映出各因素對(duì)指標(biāo)的影響程度，對(duì)多糖得率的影響因素的主次順序?yàn)樗囟?gt;加水量>水提時(shí)間。因素A的最佳水平為第二水平即水浴溫度90℃時(shí)效果最好，因素B加水量以第二水平的45ml最佳，因素C水提時(shí)間以第二水平的20分鐘較好。因此，最優(yōu)搭配為A2B2C2。按此工藝提取多糖其得率為7.8％。

2．3多糖的分離、純化

（1）蛋白質(zhì)的去除。

①Sevage法

用氯仿等有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)變性離心除去，該方法能防止多糖的降解，但除蛋白效率低，需重復(fù)多次才能除盡，同時(shí)會(huì)消耗大量的有機(jī)溶劑，并不適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。

②三氟三氯乙烷法

將多糖采用三氟三氯乙烷法除去蛋白，進(jìn)行UV掃描結(jié)果可以看出，此法脫蛋白的效率不高，而且溶液沸點(diǎn)較低，易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。

③三氯醋酸法：將多糖采用三氯醋酸法除去蛋白后進(jìn)行UV掃描顯示，盡管三氯乙酸法除去蛋白的反應(yīng)較為劇烈，可能會(huì)引起多糖的降解，使得率降低，但是三氯乙酸法除蛋白效果較好。所以本研究采用此法進(jìn)行多糖脫蛋白處理。

（2）多糖的柱層析純化：將采用三氯醋酸法去蛋白后的多糖，進(jìn)一步采用DEAE-纖維素52進(jìn)行純化，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)DEAE-纖維素52純化后，洗脫產(chǎn)物為單一組分。合并洗脫液，真空濃縮，冷凍干燥，可得到純化的多糖。

2.4多糖的鑒定

（1）淀粉的碘反應(yīng)：結(jié)果顯示，溶液沒(méi)有變藍(lán)的現(xiàn)象，說(shuō)明溶液中不含淀粉。

（2）溶解性：通過(guò)攪拌，沒(méi)有不溶物出現(xiàn)，說(shuō)明其溶解性良好。

（3）還原糖的測(cè)定：在590nm處比色，吸光值為0.012，說(shuō)明還原糖的含量低。

（4）蛋白質(zhì)的鑒定。

通過(guò)圖譜可以得知，在純化后的樣品中于250-280nm處沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明其不含蛋白質(zhì)、核酸及多肽類物質(zhì)。

（5）IR鑒定多糖中糖苷鍵的類型。

將純化得到的木瓜多糖進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果顯示純化的產(chǎn)物具有典型的多糖特征光譜。經(jīng)推測(cè)本研究純化得到的木瓜多糖很可能是α-D型吡喃糖。

（6）多糖的單糖組分鑒定。

多糖水解后的HPLC分析見(jiàn)圖2-7。

圖中所示結(jié)果顯示木瓜多糖水解后的產(chǎn)物只有一個(gè)峰，提示木瓜多糖可能只是由一種單糖組成。而且，樣品在水解后生成的單糖并非葡萄糖與半乳糖，吸收峰的主要部分在葡萄糖與半乳糖以外。具體單糖組分還需要進(jìn)一步研究加以確定。

3結(jié)論

（1）通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)水提醇沉法進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取條件為水浴溫度90℃、加水量為45ml、水提時(shí)間為30分鐘。多糖的得率為7.8％。

（2）多糖的脫蛋白的分離過(guò)程中，以三氯醋酸法的去蛋白效果最好。再經(jīng)過(guò)纖維素DEAE-52柱層析進(jìn)行純化，能得到精制的木瓜多糖。不含有淀粉和蛋白質(zhì)，游離糖的含量也很低。

（3）IR鑒定結(jié)果表明本研究得到的木瓜多糖可能是α-D型吡喃糖，HPLC對(duì)單糖組分進(jìn)行鑒定，提示其組成為非葡萄糖和半乳糖組成的單一單糖組成，具體單糖類型有待進(jìn)一步研究鑒定。

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