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造血干細胞（llematopoieticstemcells,HSC）移植可能使遺傳血液病、免疫缺陷病及惡性腫瘤等完全治愈，由于HSC移植存在以下不足而受限制：⑴為獲得足夠量移植用HSC，必須進行大規(guī)模的骨髓抽吸或餐周血分離；⑵獲得的HSC量有限；⑶HSC輸注后產(chǎn)生的成熟細胞的生物動力欠佳，移植后1-3周內(nèi)并無直接治療療效。移植前HSC培養(yǎng)擴增，可解決這些難題。當前主要有兩種：⑴細胞因子支持下篩選CD34+細胞的體外擴增；⑵基質(zhì)支持下的灌注培養(yǎng)。下面就HSC培養(yǎng)的發(fā)展、HSC擴增方法以及展望等作一綜述。

1早期HSC培養(yǎng)及啟示

1半固體培養(yǎng)體系1966年，Bradley等[1]介紹了一種新的半固體培養(yǎng)方法（即集落形成法）用以培養(yǎng)骨髓。此法利用膠體凝膠作支托，沒有細胞微環(huán)境，只能維持造血祖細胞在1-2周內(nèi)形成細胞集落，不能支持HSC的生長或分化。即使沒法加入營養(yǎng)物、生長因子等，培養(yǎng)時間也只能延長到2-4周。由半固體培養(yǎng)體系的期限性可推斷，早期原始HSC不能在這樣的培養(yǎng)體系中存活、增殖。

2Dexter培養(yǎng)體系Dexter等[2]于1977年建立了骨髓液體培養(yǎng)體系。此培養(yǎng)法基礎(chǔ)是建立一骨髓基質(zhì)細胞支持層（包括成纖維細胞、巨噬細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞和網(wǎng)狀細胞等），形成二維空間結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)體系不單提供了營養(yǎng)、細胞因子，而且提供了類似于體內(nèi)的細胞-細胞關(guān)系，使此法纖維造血8-12周[3]。極限稀釋法技術(shù)證明，在Dexter培養(yǎng)體系中，前造血祖細胞在培養(yǎng)第一周前已開始減少[4]。應(yīng)用細胞免疫表型分析提示，該體系培養(yǎng)的骨髓CD34+、CD38-細胞不能更新復制[5]。早期造血細胞體外培養(yǎng)擴增方法的研究啟示：HSC細胞可在體外培養(yǎng)，但兩種培養(yǎng)方法均沒有建立適合其體外造血的微環(huán)境。尋求建立，一個合適的人HSC培養(yǎng)體系是研究的關(guān)鍵。

2目前HSC的體外擴增方法

理想的SHC培養(yǎng)方法要求既能最大限度地擴增各階段的造血細胞，又能維持甚至擴增HSC。目前較為成功的人HSC體外擴增方法主要有兩種：⑴細胞因子支持十篩選CD34+細胞的體外擴增；⑵基質(zhì)支持下的灌注培養(yǎng)。

2.1細胞因子支持下篩選CD34+細胞培養(yǎng)

2.1.1HSC的特性HSC沒有任何形態(tài)方面的特征，也沒有獨特的免疫表型迄今尚無直接檢測的方法。HSC只能通過脾結(jié)節(jié)形成法檢測，也可通過檢測高增殖潛能集落形成單位（CFU-HPP）長期培養(yǎng)啟動細胞（LTC-IC）反映其存在。其免疫表型特征有：CD34+、Thy-1-/弱+、Lin-、CD33-、CD38-、CD45Ro-、HLA-DR-。其Rh-123熒光呈陰性或低強度，對4-HC/5-Fu有抗性。HSC是不均一的細胞群體，早期的造血細胞大部分處于G0/G1期，啟動慢，但擴增持續(xù)時間長，擴增倍數(shù)高，造血細胞產(chǎn)量高。較成熟造血細胞啟動快，短期擴增倍數(shù)高，維持時間短，產(chǎn)物多是成熟細胞，造血祖細胞產(chǎn)量少。

2.1.2細胞因子的造血調(diào)節(jié)根據(jù)細胞因子對造血細胞不同的作用階段將其分為：⑴特異性細胞因子：大多作用于分化后期，包括EPo、TPo、M-CSF、G-CSF和IL-5；⑵無系特異性細胞因子：作用于分化狀態(tài)的HSC，包括IL-3、GM-CSF和IL-4，其功能主要維持處于G0期之外所有HSC的生存、增生；⑶G0期作用細胞因子：包括IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF和SCF，維持早期HSC的存活或促其分化擴增：⑷抑制血細胞生成的細胞因子：包括TNF-α、TNF-βIFN和MIP-1α等，其中INF和TNF-Αfq系特異性，TGF-β主要抑制早期血細胞生成，MIP-α抑制原始的HSC的增殖[6]。

2.1.3擴增策略目前細胞因子支持下篩選CD34+細胞體外擴增方法研究最為普遍。實驗證明，篩選早期HSC剔除成熟的CD34-細胞進行擴增，可獲得更好的效果[7]。單獨應(yīng)用一個細胞因子擴增人HSC效果不佳，多個因子合理組合才能獲得理想的擴增效果。一般認為，生長因子合理組合應(yīng)包括：⑴抑制細胞殘死亡的存活因子，如IL-1、IL-6和SCF等⑵刺激早期造血細胞增殖的因子，如SCF、IL-3和GM-CSF等；⑶定向擴增刺激因子，如G-CSF和EPO等[9]。

Moore[10]用delta培養(yǎng)法培養(yǎng)骨髓CD34+細胞，發(fā)現(xiàn)未用因子時CFU-GM迅速消失；而單用SCF、IL-1、IL-3或IL-6等因子時，14天培養(yǎng)CFU-GM維持不變或只擴增2-8倍；用SCF/IL-3聯(lián)用另3個或3個以上因子組合擴增效果更好。多數(shù)人認為合適的細胞因子組合為IL-1/IL-3/IL-6/G-CSF/GM-CSF/SCF，14-17擴增經(jīng)動員外周血（MPB）CD34+細胞，使CFU-GM增殖66倍[11]，以擴增非MPBCD34+細胞，使CFU-GM增殖55倍[12]。而Bruggert等[13]則認為SCF/IL-1/IL-3/IL-6/EPD最適于外周血CD34+細胞擴增，12-14天培養(yǎng)，擴增CFU-GM250倍，CFU-Mix25倍。而擴增臍血CD34+、CD45RAlow、CD77low的CFU-GM（70倍）和BFU-E（55倍）的最好因子組合分別為SCF/IL-6/PIXY/M-CSF和SCF/IL-6/IL-3/EPO，擴增兩者的最佳組合是SCF/IL-6/PIXY/M-CSF/G-CSF/EPO[14]。NakahataT[15]指出，早期HSC大部分無IL-6R表達，IL-6/Sil-6R復合體激發(fā)HSC表達gp130，啟動HSC自我復制的信號傳遞，而c-Kit/SCF是HSC自我自制擴增的另一信號傳遞途徑。無血清條件下，IL-6/SIL-6/SCF孵育人臍血CD34+細胞，細胞總數(shù)和造血祖細胞數(shù)隨Sil-6R增加而明顯增加，培養(yǎng)14天，

CFU-GM擴增近70倍，集落中除了幾個CFU-M和BFU-E外，有大量（≥60%）的CFU-GEMM和CFU-Blast；有血清的情況下，培養(yǎng)7天，14天，分別擴增CFU-Mix60倍和70倍。由此說明，細胞因子促進造血是通過與期受體結(jié)合引起信號傳遞而起作用的，為體外造血研究開創(chuàng)了新的思路。

細胞因子支持下篩選CD34+細胞擴增法有以下優(yōu)越性：⑴條件容易控制，產(chǎn)量穩(wěn)定；⑵無異體基因污染。缺點是：目前還無可完全代替基質(zhì)的細胞因子，單用因子不能維持體外長期造血；需不斷加入因子，費用昂貴，不能大規(guī)模使用。

2.2基質(zhì)細胞支持的灌注培養(yǎng)

此培養(yǎng)方法提供HSC一個接近于體內(nèi)的造血環(huán)境，能擴增各階段的造血細胞，并維持甚至擴增原始HSC，稱原始HSC培養(yǎng)方法。

2.2.1基質(zhì)支持作用此作用除了通過細胞-細胞接觸的直接作用外，還分泌許多因子影響造血過程。骨髓基質(zhì)是最常用的造血支持層來源，包括基質(zhì)細胞、基質(zhì)細胞分泌的胞外基質(zhì)（膠原、纖維結(jié)合蛋白、層素、糖蛋白等）以及多種造血生長因子（如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-6、INF-α、IFN和TGF-β）調(diào)節(jié)HSC的造血動力學。用作造血支持的基質(zhì)細胞除骨髓外還包括其它許多來源的細胞?；|(zhì)細胞與HSC可以同基因或異基因、同種或異種。此外，還建立了許多轉(zhuǎn)化的基質(zhì)細胞系，用于造血支持。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的基質(zhì)細胞系具有分泌細胞因子的功能，加強造血調(diào)控。Otsukat等[16]報道，在長期培養(yǎng)體系中，以基因工程改造的成纖維細胞為支持細胞，使之分泌GM-CSF、G-CSF和IL-3因子，相同濃度下，這些因子對HSC增殖有更強的刺激作用。

直接比較基質(zhì)支持培養(yǎng)和細胞因子支持培養(yǎng)的擴增效果顯示，目前可能用到的任何細胞因子都無法完全代替基質(zhì)細胞的支持作用。因子培養(yǎng)結(jié)果，原始HSC常常減少，而只有基質(zhì)支持的培養(yǎng)可使原始HSC維持不減甚至擴增[17，18]。有實驗顯示，骨髓的LTC-IC在細胞因子支持下培養(yǎng)只維持35%的啟始量，而基質(zhì)細胞卻能令其擴增5倍[16]。臍血LTC-IC在因子作用下培養(yǎng)7天，擴增2-7倍，培養(yǎng)14天，擴增2-3倍，而基質(zhì)細胞卻可達加倍的擴增效果[19]。用微孔網(wǎng)把HSC和基質(zhì)隔開稱基質(zhì)非接觸共培養(yǎng)，近期文獻認為，HSC與基質(zhì)接觸與否并不影響增殖分化[20]。相反，非接觸可部分地使HSC與產(chǎn)生增殖負性細胞因子信號的隔開，減輕造血受抑。

2.2.2造血生長因子支持作用?；|(zhì)支持灌注培養(yǎng)常加用因子，以加強HSC的擴增效果。因子一方面支持基質(zhì)細胞，起間接造血作用，一方面直接刺激HSC存活、增殖、分化。Koller等[18]在生物反應(yīng)系統(tǒng)中，加入IL-3/IL-6/SCF培養(yǎng)臍血單個核細胞（MNC），15天培養(yǎng)擴增CFU-GM11倍、5天BFU-E2.5倍、3天CFU-Mix5.3倍及5天LTC-IC3個樣品中2個擴增3倍。他的另一實驗，基質(zhì)細胞支持培養(yǎng)不同純度的人骨髓CD34+細胞，采用多種因子組合比較，以IL-3/IL-6/SCF/EPO及IL-3/GM-CSF/SCF/EPO擴增效果最佳，細胞、祖細胞數(shù)明顯增加，而且維持LTC-IC不減[17]。

2.2.3介質(zhì)灌注作用介質(zhì)灌注是影響HSC培養(yǎng)的又一重要因素。介質(zhì)灌注可以保證營養(yǎng)、細胞因子等供應(yīng)，清除有造血抑制代謝產(chǎn)生，刺激基質(zhì)細胞分泌因子[21]?？刂七m當?shù)慕橘|(zhì)灌注，顯著地提高體外造血的效率。已知，體內(nèi)組織細胞細胞密度為5×108·ml-1的漿灌注為0.1ml·kg-1·min-1，相當于細胞密度為106·ml-1，含20%血清的培養(yǎng)介質(zhì)，每天全部更換一次。Schwartz等[22]按7V·W-1，3.5V·W-1和1V·W-1換液培養(yǎng)低密度的骨髓MNC，發(fā)現(xiàn)3.5V·W-1換液效果最好，可維持造血20周。整個過程，細胞產(chǎn)量傳統(tǒng)Dexter培養(yǎng)法的3倍，而且維持祖細胞穩(wěn)定生產(chǎn)直到18周，在已報道文獻中，造血維持時間最長。Plasson等也發(fā)現(xiàn)同樣結(jié)果。

2.2.4氧濃度的影響Koller等認為5%低氧化正常20%氧濃度更能刺激造血，實驗見CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM分別擴增12倍、3倍和4倍。此外，延長祖細胞維持時間1-2周。而Palson等的實驗則顯示20%o2最利于體外造血，40%O2次之，5%及60%O2最差。

2.2.5生物反應(yīng)器作用有人通過改進反應(yīng)器提高HSC擴增效果。如Davis等[26]利用人造血毛細血管系統(tǒng)用豬內(nèi)皮細胞支持培養(yǎng)骨髓CD34+細胞、培養(yǎng)18天，CD34+細胞擴增150倍、CFU-GM1600倍、CFU-Blast77倍，效果特點顯著。應(yīng)用該體系，造血祖細胞及早期造血細胞均獲相當高的擴增，似乎找到HSC擴增的真諦。

2.2.6培養(yǎng)啟始HSC純度影響低純化或不純化MNC灌注培養(yǎng)具有以下優(yōu)點：⑴保存盡量多的CD34+輔助細胞；⑵大量的基質(zhì)細胞在培養(yǎng)過程中可形成支持層；⑶減少篩選過程對HSC破壞。Koller等用不同純度的CD34+LIN-細胞灌注培養(yǎng)，證明CD34+LIN-細胞純度越低，擴增細胞、CFU-GM和LTC-IC倍數(shù)越高，而以后兩種最受影響。

2.2.7其它細胞接種密度和收獲時機對HSC擴增效果有一定影響。粘附因子介導HSC和基質(zhì)細胞的接觸刺激HSC增殖分化，也是不可忽視的因素。

基質(zhì)細胞支持下灌注培養(yǎng)有如下優(yōu)點：⑴維持造血時間長達數(shù)月（≥5月）；⑵可維持LTC-IC不減甚至擴增；⑶細胞因子應(yīng)用少，費用低；⑷擴增前無太多的處理，保持HSC的活性，避免去除輔助細胞。缺點是條件不易控制，產(chǎn)物不穩(wěn)定。

3展望

由于目前對HSC的特性尚未透徹了解，所以HSC體外擴增要獲得不同階段的細胞大量增殖，同時擴增原始細胞量遇到困難。以后研究可以主要集中于以下幾個方面。

3.1HSC增殖分化的調(diào)控基因研究在分子水平和基因水平把握造血的的機制，指導體外HSC的培養(yǎng)，HSC逐漸分化，喪失自我更新的能力，可有由于基因易位和重排所致。若然如此，通過基因重新復位，可使一個已經(jīng)分化的細胞返祖為HSC。在此領(lǐng)域研究信號傳導機制，可以在關(guān)鍵點阻斷HSC分化信號傳導，而加強自我更新信號傳導，提高HSC的擴增。

3.2新的造血生長因子的發(fā)現(xiàn)，目前所用的造血生長因子均無法代替基質(zhì)細胞的作用，說明仍存在某種未知的關(guān)鍵造血調(diào)控因子。致力于新的造血生長因子發(fā)現(xiàn)，將對改善HSC培養(yǎng)起巨大作用。

3.3定向細胞培養(yǎng)使HSC向某一系定向增殖是HSC培養(yǎng)的新方向。針對臨床不同需要，選擇性擴增紅細胞、粒細胞、淋巴細胞、血小板、NK細胞等具有廣闊的應(yīng)用前景。

可以相信，隨著細胞生物學，分子生物學及其相關(guān)學科和技術(shù)的發(fā)展，對HSC了解會更加明了，HSC的擴增會逐步完善。HSC擴增技術(shù)的發(fā)展將為血液系統(tǒng)疾病、腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供充足的材料和新的技術(shù)方法。

參考文獻

BradleyTR,etal.Thegrowthofmousemarrowcellsinvitro.AustJExpBiolMedSci,1966:44:287

DexterTM,etal.ConditionscontrollingtheproliferationofhaemopoieticstemcellsinvitroJCellsPysiol,1977;91:335

GartnerS,etal.Longtermcultureofhumanbonemarrowcells.ProcNatlAcadSicUSA,1980;77:4656.

SutherlandHJ,etal.Alternativemechanismswithandwithoutsteelfactorsupportprimitivehumanhematopoiesis,Blood,1993;81:1465

LansdorpPM,etal.Ontogeny-relatedchange:inproliferativepotentialofhumanhematopoieticcells.JExpMed,1993;178:787

MetcalfD,Hematopoieticregulator:redundancyorsubtlety?Blood,1993:82:3515

HeimfiedS,etal.ExvivoexpansionanalysisfromCD34+HLA-BRI,CD34±andCD38+subestEepHematol,1994(Abstr):22:756

BjomsonBH.etal.InhitionofCFU-NMandCFU-Eosbymatruregranulocytes,Blood,1984:63:376

TavassoliM,Hematopoeticsurvivalfactro.ExpHematol,1993;21:1411

MooreMA,Expansionofmyeloidstemcellsinculture.SeminHematol,199:32:183

HaylockND,etal.ExvivoecpansionandmaturationofperipheralbloodCD34+cellsintothemyeloidlineage,Blood,1992;80:4405

SatoNetal.vitroexpansionofhumanperipheralbloodCD34+cells,Blood,1993;82:3600

BruggerW,etal.ExvivoecpansionofenrichedperpheralbloodCD34+progenitorcellsbystemcellfactor,interleukin-1beta(IL-1beta),IL-6,IL-1,interferon-gamma,anderythropoietinBlood,1993:81:2579

MayaniH,etal.Cytokine-inducedselectiverexpansionandmaturationoferythroidversusmyeloidcordbloodprecurrsorcell.Blood,1993;81:3252

NakahataT,Expansionofhematopoieticprogenitors.In:BajusJL,etal.eds,EducationProgramofThe26thCongressofTheIntemationalSocietyofHaematologySingapore,1996;29-302

OsykaTetal.Theeffectsofinterleukin-6andinterleukin-3onearlyhematopoieticeventsinlong-termculturesofhumanmarrow,ExpHematol,1991;19:1042

KollerMR,etal.Long-termcultureinitiatingcellexpansionisdependentonfrequentmediumexchangecombinedwithstromalandotheraccessorycelleffects.Blood,1995;86:1784

KollerMR,etal.ExpansionofprimitaivehumanhematopoieticprogenitorsinaperfusionbioreactorsyystemwithIL-3,IL-6andstemcellfactor.Biotechnology,1993;11:358

HanCS,etal.Invitroexpansionofumbilcalcordbloodcommittedandprimitiveprogenitors.ExpHematol,1994(Astl):22:723

VerfaillieCM,Directcontactbetweenhumanprimitivehematopoieitcprogenitorsandbonemarrowstuomaisnotrequiedforlong-terminvitrohematopoiesis,Blood,1992;79:2821

GubaSC,etal.BonemarrowstromalcellssecreteIL-6andGM-CSFintheabsenceofinflammatorystimuli:demonstrationbyserum-fredbioassay:ELSA,andreversetranscriptasepolymerasechair,reaction,Blood,1992;80:1190

SchwartzRM,etal.Rapidmediumperfusionratesignificantlyincreasestheproductivityandlogevityofhumanbonemarrowcultures.ProcNatlAcadSciUSA,1991;88:6760

PalssonMA,etal.ExpansionofCD34+-enrichedhumanbonemarrowcells:effctofheedingscheduleschedulecytokinesandstuoma.ExpHematol,1994(Abstr):22:726

KollerRM,etal.Reducedoxygentemsionincreaseshematopoiesisinlong-termcultureofhumanstemandprogenitorcellsfromcordbloodandbonemarrow.ExpHematol,1992:20:264

PalssonBO,etal.Expansionofhumanbonemarrowprogenitorcellsinahighcelldesitycontinuousperfusionsystem.Bio-Technol,1993;11:368

DavisTA,etal.LargescaleexpansionofhumanCD34+progentorcellsonporcineendothelialcellsinandartificalcapillarysystem,Exp,Hematol,1994