前言：想要寫出一篇令人眼前一亮的文章嗎？我們特意為您整理了5篇歲末感言范文，相信會為您的寫作帶來幫助，發(fā)現(xiàn)更多的寫作思路和靈感。

歲末感言范文第1篇

Abstract: According to the construction of railway tunnel in Lanyu line， in this paper， long bolt is the main method to control the displacement. It provides the process of numerical simulation of tunnel type anchorage and analyzes the stability of surrounding rock. In the soft surrounding rock tunnel， the reinforcement effect of the advanced long bolt is better than that of the common bolt.

關鍵詞： 錨固試驗；軟弱圍巖；長錨桿；數(shù)值模擬

Key words: anchoring test；soft surrounding rock；long bolt；numerical simulation

0 引言

目前，普遍應用于地質(zhì)條件較好的巖土工程中的錨桿，其支護效果表現(xiàn)良好。但在圍巖松軟破碎、高地應力等復雜條件下的大變形隧道中，錨桿支護仍然是尚待解決的難題。國內(nèi)外錨桿支護正朝著提高錨固力、提高支護效率、擴大應用范圍方向發(fā)展。普遍認為開發(fā)具有強初撐、急增阻、高阻力力學特性的錨桿支護，是控制高應力、軟巖大變形隧道的有效途徑，是錨桿支護的主要發(fā)展方向[1]。

本文以蘭渝線蘭州至廣元段鐵路隧道施工為工況模擬背景，針對該工程隧道開挖中圍巖大變形問題（開挖變形達25cm），以長錨桿作為變形控制的主要手段，對現(xiàn)場試驗進行模擬對比驗證計算，為完善軟巖大變形控制方法提供進一步依據(jù)。

1 工程概況

該工程位于甘肅省岷縣縣城東邊。隧道于洮河右岸岷縣奈子溝村東側(cè)山坡（DK201+820）進洞，在岷縣正龍骨料飼料廠后山坡（DK206+955）出洞。隧道全長5135m，為雙線隧道。隧道進、出口位于國道G212路邊，交通方便。洞身段落山大溝深，地形起伏很大，距離國道較遠，交通不便。該工程地貌上位于西秦嶺中山區(qū)。山高溝深，山坡、谷坡較陡，隧道洞身最大埋深248m，梁頂植被覆蓋較好。該隧道洞身經(jīng)過的地層有第四系全新統(tǒng)坡積砂質(zhì)黃土、碎石土；二疊系下統(tǒng)炭質(zhì)板巖、板巖、砂巖，三疊系中統(tǒng)板巖、砂巖等。山坡表層覆蓋有第四系全新統(tǒng)坡積黏質(zhì)黃土，坡積、滑坡堆積粗角礫土、碎石土等。

2 錨固試驗施工方法

考慮到成本投入和施工的便利性、可操作性，制定方案主要如下。以長錨桿作為變形控制的主要手段設置試驗段，沿中線對稱布置，錨桿鉆孔施作采用專用幫錨桿機。分三組試驗：第一組錨桿長3m；第二組錨桿長6m；第三組錨桿長8m；錨桿間距均為1m。錨桿布置情況如圖1所示。該控制措施效果富余時，可再確定加大錨桿間排距試驗，以便于確定合理的加固措施。其中3m、6m、8m長錨桿分別選用?準22螺紋鋼、?準42注漿鋼管、?準70注漿鋼管，其施作富余部分與鋼拱架焊接，鎖定鋼拱架。施作步驟：鉆孔快硬水泥卷與螺紋鋼端頭插入送快硬水泥卷與螺紋鋼入孔注漿螺紋鋼鎖定鋼拱架。

3 模擬計算及分析

為分析錨桿對隧道圍巖變形控制的影響，根據(jù)實際工程的地質(zhì)條件分別進行錨桿長度和直徑的對比試驗的模擬研究。

3.1 隧道計算范圍及地質(zhì)條件 隧道左右側(cè)邊界為隧道開挖洞徑的4倍，上下側(cè)為隧道開挖洞徑的3倍（隧道毛斷面凈高12.5m，跨度14.0m）。依據(jù)地形條件加載自重應力。圍巖為Ⅴ級，處在F3斷層內(nèi)，隧道洞身二疊系～三疊系板巖、砂巖巖體節(jié)理裂隙發(fā)育，工程地質(zhì)條件差。 轉(zhuǎn)貼于

3.2 計算單元和計算參數(shù)的選取 根據(jù)隧道結(jié)構(gòu)的不同部分的特點選用合適的單元可以使模型更加接近工程實際，提高計算精度，減小解題規(guī)模。本次模擬采用ANSYS軟件對隧道開挖采用二維方式模擬，計算采用了三種單元，用實體單元PLANE42模擬圍巖和挖去的土體單元，用桿單元LINE1模擬隧道錨桿，用梁單元BEAM3模擬噴射混凝土和鋼拱架。主要模擬計算參數(shù)噴射混凝土：厚度0.3m，彈性模量30e9Pa，泊松比0.2，密度2551kg/m3；圍巖：彈性模量1.3e9Pa，泊松比0.38，凝聚力0.2e6Pa，內(nèi)摩擦角21；錨桿：彈性模量200ePa，泊松比0.3，密度7840kg/m3 。

3.3 數(shù)值模擬分析 采用ANSYS軟件對長錨桿支護軟弱圍巖隧道方案進行模擬，取經(jīng)過隧道縱軸線的圍巖立面為研究對象，分別得到27根4米錨桿、26根6米錨桿、12根8米錨桿作用下的圍巖豎向位移分布云圖。

3.3.1 以ANSYS模擬開挖和支護效果，選取合理的模擬計算參數(shù)十分重要，經(jīng)多次反復調(diào)試及驗證才能獲得有效的接近工程實際的模擬云圖。

3.3.2 位移控制效果分析。如圖2，27根3m錨桿控制最大變形量為18.947cm，26根6m錨桿控制最大變形量為14.009cm，12根8m錨桿控制最大變形量為14.7cm，且都發(fā)生在仰拱處，可見，優(yōu)化的錨桿設置控制變形最為有效。由錨桿軸力圖知，錨桿近端軸力大，遠端軸力小，而且拱頂軸力比兩側(cè)的大，且錨桿的軸力相對于隧道結(jié)構(gòu)來說是對稱的。

3.3.3 圍巖穩(wěn)定性分析。在長錨桿的作用下，由于長錨桿較強的錨固力作用，改善了圍巖的應力狀態(tài)，臨空面附近穩(wěn)定性較弱的巖體與深部穩(wěn)定性較好的巖體通過長錨桿連接在一起，增強了巖體結(jié)構(gòu)的整體作用，使得圍巖的整體性和承載能力得到了提高，圍巖的穩(wěn)定性亦顯著提高。

4 結(jié)論

4.1 對現(xiàn)場試驗進行數(shù)值模擬計算，為軟巖大變形控制方法的研究提供了一定的依據(jù)。

4.2 大變形隧道錨桿與圍巖相互作用雖取決于圍巖的力學特性以及隧道所處地形情況，但長錨桿對軟弱圍巖隧道的變形也具有一定的控制作用，長錨桿能夠改變圍巖的力學特性，提高圍巖的自承能力，減少圍巖變形，保持隧道圍巖的穩(wěn)定性。

4.3 針對具體地形以及隧道圍巖的力學性質(zhì)等因素優(yōu)化錨桿設置，對于軟弱圍巖隧道，長錨桿的設置對圍巖的加固效果優(yōu)于普通錨桿設置。

參考文獻

[1]孫鈞.巖土力學與地下工程結(jié)構(gòu)分析的若干進展[J].力學季刊，2005，26（3）：329-338.

孫鈞.地下結(jié)構(gòu)有限元法解析[M].上海：同濟大學出版社，1988.

鄭穎人，趙尚毅，鄧楚鍵等.有限元極限分析法發(fā)展及其在巖土工程中的應用[J].中國工程科學，2006，8（12）：39-61.

歲末感言范文第2篇

【關鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細胞； 肺氣腫； 移植

慢性阻塞性肺疾?。璺?，COPD）嚴重影響人類健康，與慢性支氣管炎及阻塞性肺氣腫密切相關，而阻塞性肺氣腫可出現(xiàn)肺泡、支氣管上皮細胞的損傷，造成肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，且隨著病情進展，肺功能進行性下降?，F(xiàn)行的內(nèi)科治療手段是盡早去除致病因素，最大限度減少損傷細胞的數(shù)量及損傷程度，但往往無滿意的療效。肺移植是目前終末期間質(zhì)性肺疾病、慢阻肺患者唯一有效的治療方法，但由于存在供體數(shù)量的下降、免疫排斥反應等問題而限制了其應用。目前人民迫切尋求一種新的、組織替代療法來治療這類不可逆的肺部疾病。骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）由于來源方便、分離簡單、擴增迅速，可以取材于患者本人，傳代擴增并定向誘導為特異細胞后，回輸給患者本人，安全性高，免疫原性低，且具有多向分化潛能引起廣泛的關注，被認為是細胞移植和組織工程的種子細胞[1-3]。本實驗將骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）經(jīng)尾靜脈注入肺氣腫大鼠體內(nèi)，觀察MSCs植入大鼠體內(nèi)后在肺組織中的存活，為MSCs治療慢阻肺提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠MSCs的體外分離與鑒定 （1）MSCs的分離與培養(yǎng)：無菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，無菌PBS沖洗骨髓腔獲取骨單細胞懸液，將單細胞懸液1000 r/min，離心5 min，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培，每3天換液一次。倒置相差顯微鏡逐日觀察并記錄的形態(tài)及生長情況，當細胞融合達90%時，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。取第4代MSCs進行鑒定。（2）流式細胞儀檢測細胞CD表型：取第3代MSCs，生長至90%融合時PBS洗滌2次，1×106的MSCs重懸于含0.1 mL PBS的PE管中，各管加入CD34、CD45、CD44及CD29，加入抗兔FITC，室溫孵育40 min，流式細胞儀檢測上述細胞表型，陰性對照為未加熒光抗體的MSCs細胞懸液。

1.2 移植MSCs的培養(yǎng)、標記 取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2 mL含（1～2）×105個細胞培養(yǎng)液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)至40%～50%匯合時轉(zhuǎn)染（匯合過度，不利于轉(zhuǎn)染細胞）。PBS洗細胞，10% FBS的DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞的綠色熒光，棄病毒混合培養(yǎng)液，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后攜帶GFP的MSCs（GFP-MSCs）按1：3傳代培養(yǎng)，取第4代MSCs進行鑒定。

1.3 實驗動物分組及大鼠肺氣腫模型建立 SD大鼠34只按隨機數(shù)字表分為四組，MSCs干預組（A組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注MSCs 1×106個/mL），肺氣腫模型組（B組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS）及MSCs對照組（C組，10只，正常大鼠，尾靜脈輸注MSCs 1×106個/mL），正常對照組（D組，4只，正常大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS）。采用煙熏法復制大鼠肺氣腫模型。將A、B組大鼠置于煙室內(nèi)，采用靜式吸入染毒方法，10支椰樹牌香煙置于吸煙孔內(nèi)，點燃香煙，每支香煙每分鐘吸一次，35 mL/次，收集主流煙氣和側(cè)流煙氣，通過塑料軟管與熏煙箱相連，將煙霧導入熏煙箱。其間，每隔5秒將箱內(nèi)流風機開啟10 s，使箱內(nèi)氣體分布均勻。8 min香煙點燃完畢，關閉吸煙系統(tǒng)。動物每次暴露45 min，45 min后取出動物，清洗熏煙箱。2次/d，共12周。煙霧暴露時動物可在箱內(nèi)自由取食飲水。按上述方法將MSCs干預組第3代的轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的間充質(zhì)干細胞（每只1×106個/mL）尾靜脈注入A組大鼠體內(nèi)，B組注入等體積PBS；C組在相同時間內(nèi)注入1×106個/mL骨髓間充質(zhì)干細胞等，D組注入等體積PBS，注入后24 h內(nèi)處死大鼠，取肺組織迅速冰凍切片，共聚焦激光顯微鏡下觀察觀察轉(zhuǎn)染GPF的間充質(zhì)干細胞在大鼠肺內(nèi)定植情況。第3代的轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的間充質(zhì)干細胞（每只1×106）進行下一步實驗。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，以P

2 結(jié)果

2.1 MSCs培養(yǎng)與鑒定 原代培養(yǎng)的MSCs第24小時即可見梭形細胞貼壁生長，到第6天時有大量梭形細胞呈克隆生長，第10天左右細胞可長滿皿底。細胞長滿后與成體MSCs相似，呈旋渦狀（圖1）。按1：3進行傳代培養(yǎng)，細胞在體外培養(yǎng)可穩(wěn)定傳至48代，在第4代做流式細胞表型鑒定，符合目前公認間充質(zhì)干細胞細胞表型標志。經(jīng)流式細胞儀檢測，分離細胞傳至第4代時有99.5%表達CD44、99.6%表達CD29等間充質(zhì)干細胞表面標志，0.4%表達CD34、1.0%表達CD45單核細胞以及造血干細胞表型（圖2）。

圖1 MSCs的原代培養(yǎng)（×400）

注：原代培養(yǎng)的MSCs第10天左右細胞長滿皿底后，成體MSCs相似，呈旋渦狀。

2.2 SD大鼠肺氣腫模型的建立 香煙煙霧暴露后A、B組大鼠小氣道上皮呈鋸齒狀增生增厚，上皮脫落，纖毛倒伏，氣管內(nèi)見大量炎性滲出物，管壁結(jié)締組織增生，可見炎性細胞，及淋巴小結(jié)。肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁斷裂，肺泡腔擴大，部分融合成肺大皰（圖3A）。C、D對照組大鼠小氣道黏膜上皮完整，纖毛未見黏連脫落，管壁規(guī)整未見增厚，未見炎細胞浸潤，管腔內(nèi)未見炎性滲出物，肺泡腔未見病理性擴大（圖3B）。

香煙煙霧暴露組（A、B組）平均肺泡間隔為（119.0±26.2）μm，高于對照組（C、D組）的（89.8±17.3）μm，差異有統(tǒng)計學意義（P

表1 大鼠肺組織病理學改變情況（x±s）

組別 支氣管數(shù)

（只） 平均肺泡間隔（μm） 肺泡數(shù)

（個/mm2）

對照組（n=14） 27 89.8±17.3 280.3±104.0

香煙組（n=20） 28 119.0±26.2 173.86±68.3

F值 - 3.8 4.7

P值 -

2.3 各組轉(zhuǎn)染GPF綠色熒光蛋白的表達 取第8代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞，調(diào)整合適的間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)密度，細胞融合40%～5%時轉(zhuǎn)染GPF綠色熒光蛋白質(zhì)粒，24 h后觀察轉(zhuǎn)染效果，在轉(zhuǎn)染GPF綠色熒光蛋白質(zhì)粒后48～96 h表達效果最好，質(zhì)粒發(fā)光強度大、數(shù)量多，效率可達40%左右。微共聚焦發(fā)現(xiàn)MSCs經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)24 h后，A組大鼠肺組織內(nèi)可見攜帶MSCs的綠色熒光，而B組、C組及D組均未見轉(zhuǎn)染熒光（圖4）。

3 討論

慢阻肺是一種全球性患病率較高的疾病，40歲以上人群，慢阻肺患病率為8.2%[5]。其患病率之高十分驚人，死亡率高，目前居全球死亡原因的第4位，經(jīng)濟負擔重，已成為世界第5大負擔的疾病，由于慢阻肺的發(fā)病機制復雜，病理改變可引起氣道結(jié)構(gòu)重塑、肺泡結(jié)構(gòu)破壞及肺血管減少，依靠機體的自我再生能力無法達到完全的修復，導致病情進行性進展。目前慢阻肺的內(nèi)科治療以抗炎、擴張支氣管、氧療、呼吸運動鍛煉及增強免疫力等來緩解患者癥狀及降低患者未來健康惡化的風險，其作用非常有限，外科肺減容術及經(jīng)纖支鏡肺減容術等治療目的在于緩解癥狀和改善生活質(zhì)量，二者均不能阻止病情的進行性發(fā)展。因此，如能尋找到一種有效修復氣道及肺部組織結(jié)構(gòu)，從而恢復肺功能的方法，將在慢阻肺的治療上將具有里程碑式的意義。

骨髓間充質(zhì)干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。在一定條件下它可分化為心肌細胞、支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞等多個胚層來源的細胞[6-8]。而且骨髓間充質(zhì)干細胞在體外易于分離、培養(yǎng)和擴增，免疫原性低，使其在組織工程、細胞移植、基因治療等領域具有十分廣闊的應用前景[1]。近年來許多研究表明，干細胞移植可能為某些肺部疾病的治療帶來新希望[9-13]。1995年Pereira等[14]從表達人小基因膠原酶I的轉(zhuǎn)基因鼠中分離獲得成年骨髓間充質(zhì)干細胞，體外擴增、培養(yǎng)，再通過尾靜脈注射入受致死劑量照射的小鼠中，1～5個月后，發(fā)現(xiàn)肺實質(zhì)、骨、軟骨細胞中都含有膠原酶I陽性的細胞，骨髓來源干細胞移植移植到博萊霉素肺纖維化小鼠體內(nèi)，可產(chǎn)生肺泡I型細胞，并使其肺纖維化程度得到改善。目前MSCs在肺部疾病治療研究主要集中于急性肺損傷與肺間質(zhì)纖維化，在慢阻肺中的研究較少，骨髓間充質(zhì)干細胞是否在慢阻肺大鼠體內(nèi)定植、分化呢？本研究通過全骨髓貼壁法獲得了足夠數(shù)量和活力的骨髓間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)的MSCs不表達CD34和CD45，表達CD29和CD44，在一定的誘導條件下可向脂肪細胞骨細胞及軟骨細胞分化，提示成功培養(yǎng)MSCs。應用GFP標記的MSCs可表達綠色熒光蛋白，可應用于體內(nèi)實驗。筆者應用香煙煙熏成功復制肺氣腫大鼠，觀察經(jīng)尾靜脈注入的MSCs在肺氣腫大鼠肺內(nèi)的生存。將轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)尾靜脈輸注入肺氣腫模型大鼠體內(nèi)，經(jīng)快速冰凍切片發(fā)現(xiàn)肺氣腫模型大鼠肺內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細胞有骨髓間充質(zhì)干細胞定植，這與Kidds等[15]報道相一致，為MSCs治療慢阻肺提供理論基礎。

參考文獻

[1] Le B K，Tammik C，Rosendahl K，et al.HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells[J].Exp Hematol，2003，31（10）：890-896.

[2] Sun Y Q，Deng M X，He J，et al.Human pluripotent stemcell-derived mesenchymal stem cells prevent allergic airway inflammation in mice[J].Stem Cells，2012，30（12）：2692-2699.

[3] Luo D，Yan X，Liu D，et al.Differential effects of mesenchymal stem cells on a heterogeneous cell population within lung cancer cell lines[J].Mol Cell Biochem，2013，378（1-2）：107-116.

[4] Menge T，Zhao Y，Zhao J，et al.Mesenchymal stem cells regulate blood-brain barrier integrity through TIMP3 release after traumatic brain injury[J].Sci Transl Med，2012，4（161）：150-161.

[5] Zhong N，Wang C，Yao W，et al.Prevalence of chronic obstructive pulmonary disease in China： a large， population-based survey[J].Am J Respir Crit Care Med，2007，176（8）：753-760.

[6] Kotton D N，Ma B Y，Cardoso V，et al.Bone marrow-derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium[J].Development，2001，128（24）：5181-5188.

[7] Wang G，Bunnell B A，Painter R G，et al.Adult stem cells from bone marrow stroma differentiate into airway epithelial cells： potential therapy for cystic fibrosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（1）：186-191.

[8] Gregory C A，Prockop D J，Spees J L.Non-hematopoietic bone marrow stem cells： molecular control of expansion and differentiation[J].Exp Cell Res，2005，306（2）：330-335.

[9] Yen C C，Yang S H，Lin C Y，et al.Stem cells in the lung parenchyma and prospects for lung injury therapy[J].Eur J Clin Invest，2006，36（5）：310-319.

[10] Spaeth E L，Kidd S，Marini F C.Tracking inflammation-induced mobilization of mesenchymal stem cells[J].Methods Mol Biol，2012，904（12）：173-190.

[11] Kidd S，Spaeth E，Watson K，et al.Origins of the tumor microenvironment： quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma[J].PLoS One，2012，7（2）：e30 563.

[12] Zhang W G，He L，Shi X M，et al.Regulation of transplanted mesenchymal stem cells by the lung progenitor niche in rats with chronic obstructive pulmonary disease[J].Respir Res，2014，15（5）：33.

[13] Scarritt M E，Bonvillain R W，Burkett B J，et al.Hypertensive rat lungs retain hallmarks of vascular disease upon decellularization but support the growth of mesenchymal stem cells[J].Tissue Eng Part A，2014，20（9-10）：1426-1443.

[14] Pereira R F，Halford K W，O'Hara M D，et al.Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone， cartilage， and lung in irradiated mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（11）：4857-4861.

歲末感言范文第3篇

[關鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細胞；骨組織工程；細胞膜片；磷酸三鈣

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）03-0408-03

Engineering bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell sheet and β-tricalcium phosphate ceramic

MA Dong-yang1,MA Jing2,JIANG Dong-hong3,WANG Jian-feng3

(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,2. Department of Otolaryngology,3. Department of Medical Administration，Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730052,Gansu,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) sheet and β-tricalcium phosphate ceramic (TCP).MethodsWe first harvested a cell sheet from rabbit BMSCs using a continuous culture method and a scraping technique. The cell sheet was then wraped around a cylinder of β-TCP. Finally,the constructs were implanted into the subcutaneous pockets of nude mice for in vivo experiments. Gross view and histological examinations were performed to evaluate the harvested specimens. Results The cell sheet, with an average thickness of 158 mm, was composed of multi-layered cells separated in the extracellular matrix. Six weeks after implantation, the new bone tissue was present both on the edge and at the center of the TCP in sheet-TCP group. A layer of woven bone formed in the cell-sheet group. In contrast, the TCP was filled only with fibrous tissue in the TCP group,without evidence of bone formation.ConclusionThe study indicates that the combination of osteogenic BMSC sheet and β-TCP ceramic can engineer bone tissue and the engineered construct might be considered as a promising substitute for bone repair.

Key words:bone mesenchymal stem cell; bone tissue engineering; cell sheet; β-tricalcium phosphate

近年來，隨著再生醫(yī)學的迅速發(fā)展，組織工程有望為骨缺損提供理想的修復方法[1]。組織工程骨的傳統(tǒng)構(gòu)建方法是將具有成骨分化功能的種子細胞與三維支架材料復合[1-2]。細胞在體外擴增后常用胰蛋白酶消化成離散細胞懸液，在此過程中，細胞自分泌的細胞外基質(zhì)、細胞-基質(zhì)連接、以及細胞-細胞連接等結(jié)構(gòu)都被破壞，而這些結(jié)構(gòu)對于細胞分化、特異性表型維持、分泌、組織形成等功能非常重要[3]。再者，細胞與支架材料直接復合的方法存在細胞利用率低的缺點[4]。為了解決上述問題，我們提出新的組織工程構(gòu)建策略，即應用細胞膜片與可降解的外源性支架材料復合來構(gòu)建工程化骨組織。為驗證這一構(gòu)想，本研究選用來源豐富、容易獲取、體外擴增速度快、安全實用性、無倫理學爭議的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)作為種子細胞來構(gòu)建細胞膜片，同時選擇具有良好的生物相容性、可降解性、與松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)類似的多孔樣磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate, TCP)作為支架材料。

1材料和方法

1.1 材料：3月齡成年新西蘭大耳白兔，體重2.6～3.0kg，雌雄不限，由總醫(yī)院動物中心提供。6周齡裸鼠(NIH strain, outbred) 購自中國科學院上海實驗動物中心。DMEM培養(yǎng)基（購自Gibco, Invitrogen Corp）；L－谷胺酰胺、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶（均購自美國Sigma公司，胎牛血清(杭州四季青公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱(Forma公司3110Ⅱ，美國)，倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympas IX71. A21PH, 日本)，離心機(Heraens Cryofuge 8000, 德國)，一型超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs分離、培養(yǎng)、及細胞膜片構(gòu)建：氯胺酮（10 mg/kg）肌內(nèi)注射麻醉下，切取兔雙側(cè)髂骨并劈開，用含200 U/ml肝素的低糖DMEM沖洗髓腔、過濾骨髓、離心、棄上清、加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打成單細胞懸液，接種到直徑為10cm的普通培養(yǎng)皿里。加入含100 U/ml 青霉素、10%胎牛血清、50mg/L抗壞血酸、0.27g/L L-谷胺酰胺的低糖DMEM，置于37℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2天更換培養(yǎng)液一次。當細胞達90%融合時，用0.25%胰酶消化后按1:3 傳代，換成含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，90%融合時再消化，按密度1×105個/cm2接種到直徑為10cm的培養(yǎng)皿。細胞融合后，更換為含10%胎牛血清，1×10-7mol/L地塞水松，50mg/L抗壞血酸，10mmol/L β-甘油磷酸鈉的高糖DMEM條件培養(yǎng)液，每隔2 天換培養(yǎng)液1次，經(jīng)2周的連續(xù)培養(yǎng)，用細胞刮刀由外周向中心沿底壁仔細刮起，獲得完整的細胞膜片[5]。

1.2.2 細胞膜片顯微結(jié)構(gòu)觀察：隨機選取所獲細胞膜片，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切成5μm厚切片，蘇木精－伊紅染色（H&E）光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。部分膜片樣本經(jīng)丙酮固定，鈣鈷法進行堿性磷酸酶染色。部分膜片經(jīng)2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脫水，干燥，噴金，掃描電子顯微鏡觀察標本表面形貌及層面結(jié)構(gòu)。

1.2.3 體內(nèi)試驗：實驗組將單層細胞膜片剪切成10mm×25mm的長方形狀（圖1A），并由一端卷起包裹預制成的TCP圓柱體（直徑0.8cm，高度1.0cm，70%孔隙率，平均孔徑450± 50μm，圖2A、B），靜置孵育24h后移植到裸鼠背部皮下。作為對照，相同大小的細胞膜片和同規(guī)格經(jīng)成骨培養(yǎng)基孵育24h的單純材料也進行皮下移植。術后6周處死動物取材，進行大體觀察及組織形態(tài)學分析：①組織學定性分析：各樣本經(jīng)石蠟包埋、切片后HE及Mallory 三色染色光鏡觀察；②組織學半定量分析：每組每例樣本連續(xù)4張5μm厚切片，橫貫整個樣本，Mallory 三色染色后由獨立的觀察者采用NIH Image J圖像分析系統(tǒng)在10倍鏡下分析切片中骨樣組織（磚紅色）與纖維組織（淡藍色）所占的面積百分比。每張切片隨機選取4個視野，計量后收集各組數(shù)據(jù)，取其平均值。

2結(jié)果

2.1 膜片的構(gòu)建：融合BMSCs經(jīng)過2周連續(xù)培養(yǎng)，皿底有透明乳白色薄膜樣物質(zhì)形成，表面散在多個白色結(jié)節(jié)。用細胞刮沿皿底輕刮即可使其與培養(yǎng)皿底分離，刮起后膜片自行收縮，具有彈性和較穩(wěn)定的機械性能，可以用鑷子或血管鉗進行鉗夾操作。HE染色，所獲膜片具有類似三維結(jié)構(gòu)，由約8～10層細胞及細胞外基質(zhì)組成，厚度平均158μm （圖1B）。掃描電鏡下觀察：膜片中細胞被細胞外基質(zhì)包埋，基質(zhì)表面可見礦化結(jié)節(jié)聚集（圖2C）。

2.2 體內(nèi)實驗

2.2.1 移植6周后：實驗組和TCP組取材標本的形狀與移植前無明顯變化，但前者表面較硬，容易與周圍軟組織分離，后者表面被覆一層質(zhì)軟的纖維組織，不易分離。膜片組見紙片狀硬質(zhì)組織形成。

2.2.2 組織學結(jié)果：實驗組的外周表現(xiàn)為礦化程度較高的板層狀骨組織，可見致密骨基質(zhì)、骨陷窩、骨細胞、成骨細胞等結(jié)構(gòu)，材料內(nèi)部的孔隙中央為纖維組織，周邊見低度礦化的小梁骨（圖3A、B、C）。組織定量學分析，骨與纖維組織的所占面積分別為22.5%和59.6%。單一TCP組孔隙內(nèi)為纖維組織（面積比為76.1%），未見骨或軟骨樣組織。單純膜片組見片狀編織骨形成，致密的骨基質(zhì)中可見類髓腔樣結(jié)構(gòu)（圖3D）。

3討論

本研究證實了BMSC膜片與多孔TCP支架材料復合構(gòu)建組織工程骨的可行性。與傳統(tǒng)方法相比，本研究應用的構(gòu)建方法具有以下優(yōu)點：①采用物理刮治的方法將體外擴增的細胞連同培養(yǎng)過程中自分泌的細胞外基質(zhì)、形成的細胞基質(zhì)連接一同收集，避免了傳統(tǒng)用胰蛋白酶消化的有創(chuàng)收集方法；②具有較高的細胞利用率。

細胞膜片技術由日科學家Okano等[6]發(fā)明，他們將溫度敏感性聚合物凝膠涂層于普通培養(yǎng)皿底壁制備出了溫敏性培養(yǎng)皿，在37℃時聚合物對其表面擴增融合的單層細胞膜片有絕對親和性，但降至其臨界溶液溫度32℃以下時，此聚合物對單層細胞膜片的親和性消失，使細胞膜片自動從培養(yǎng)皿底壁釋放。該培養(yǎng)技術避免了對細胞進行傳統(tǒng)胰蛋白酶消化等處理，進而保留了細胞自分泌的細胞外基質(zhì)以及一些重要的細胞表面蛋白如離子通道、生長因子受體、細胞-細胞連接蛋白。利用此技術，角膜、皮膚、心肌、肝組織等多種細胞密集型軟組織已被成功構(gòu)建[3]，但在用于骨組織方面的研究較少。2007年，Zhou等[4]首先報道用細胞膜片技術與復合離散細胞懸液的聚合物-陶瓷材料（磷酸三鈣-聚已酸內(nèi)酯復合物）構(gòu)建出組織工程骨；Gao等[7]則用多層細胞膜片與管狀珊瑚構(gòu)建出管型骨。Okano等獲取膜片的技術操作程序較復雜，而且應用溫敏聚合物，可能會影響細胞的增殖分化。同時該技術獲得的膜片為單層細胞組成，厚度只有約10μm[8]。相比之下，我們的細胞膜片獲取方法簡單易行，無需特殊材料或者設備，而且由多層細胞及細胞外基質(zhì)組成，厚度可達158μm，更像三維結(jié)構(gòu)的組織。另外，一定的厚度賦予了膜片相應的彈性和較穩(wěn)定的機械性能，增加了可操作性。本研究則用單層膜片與已用于臨床的人工骨替代材料TCP復合。

有趣的是，實驗組中，不僅在支架材料的外周有礦化程度較高的骨組織形成，而且在材料內(nèi)部也可見相當數(shù)量的骨小梁。這一結(jié)果表明：作為細胞釋放載體系統(tǒng)，細胞膜片可賦予無機材料以生物活性。另一個有趣的結(jié)果是，與單純材料組相比，實驗組材料孔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)的纖維組織量較少，意味著細胞膜片在促進成骨的同時阻止了纖維組織的張入，有望成為新型的具有生物活性的組織引導再生膜。

組織工程骨要取代自體骨移植大范圍應用于臨床，首先需要解決大體積支架內(nèi)部細胞的氧氣、營養(yǎng)供應以及代謝產(chǎn)物排泄。種子細胞在體外依賴于培養(yǎng)介質(zhì)提供營養(yǎng)，而植入到體內(nèi)后，如同非血管化的游離骨移植，則需依靠受區(qū)組織液的彌散滲透作用獲得營養(yǎng)。然而，理論上體內(nèi)環(huán)境通常所能提供的最大彌散距離是150～200μm，因此大體積復合物內(nèi)相當數(shù)量的細胞因為無法獲取營養(yǎng)物質(zhì)并排泄代謝產(chǎn)物而死亡[9-10]。盡管已有諸多方法可促進組織工程植入物與宿主血管網(wǎng)的緊密聯(lián)系，提高細胞成活率和組織修復功能，但目前為止，任何促進血管生長的方法都需要5～7天以上時間才能使植入細胞獲得血液供應，在這段時間內(nèi)，細胞需從組織液中獲得足夠營養(yǎng)[10]。本實驗所應用的BMSC膜片厚度為 158μm左右，在有效組織彌散范圍內(nèi)。我們推測將其植入體內(nèi)后易于成活，有利于提高細胞治療的效率。

[參考文獻]

[1]Meijer GJ,de Bruijn JD,Koole R,et al. Cell-based bone tissue engineering[J]. PLoS Med,2007,4(2):e9.

[2]Quarto R,Mastrogiacomo M,Cancedda R,et al. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells[J].N Engl J Med,2001,344(5):385-386.

[3]Yang J,Yamato M, Shimizu T, et al. Reconstruction of functional tissues with cell sheet engineering[J]. Biomaterials,2007,28(34):5033-5043.

[4]Zhou Y,Chen F,Ho ST,et al. Combined marrow stromal cell-sheet techniques and high-strength biodegradable composite scaffolds for engineered functional bone grafts[J]. Biomaterials,2007,28(5):814-824.

[5]Ma D,Ren L,Liu Y,et al. Engineering scaffold-free bone tissue using bone marrow strom cell sheets[J].J Orthop Res,2010,28(5):697-702.

[6]Okano T,Yamada N,Sakai H,et al. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide)[J].J Biomed Mater Res,1993,27(10):1243-1251.

[7]Gao Z,Chen F,Zhang J,et al. Vitalisation of tubular coral scaffolds with cell sheets for regeneration of long bones: a preliminary study in nude mice[J].Br J Oral Maxillofac Surg,2009,47:116-122.

[8]Iwata T,Yamato M,Tsuchioka H,et al. Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model[J].Biomaterials,2009,14:2716-2723.

[9]Ren LL,Ma DY,Feng X,et al. A novel strategy for prefabrication of large and axially vascularized tissue engineered bone by using an arteriovenous loop[J].Med Hypotheses,2008,71(5):737-740.

歲末感言范文第4篇

這個下午，我們都在讀雪

入心的柔，熱飲的暖

持續(xù)到傍晚。路燈的

溫和，讓先前撲棱著的

那些鳥兒，安靜地歸巢

小酌。淡雅彌漫著

伸出在窗外。次第

梨花白，一地可愛的

貓咪。雪守望著幸福

和來年的春光

春天來了

下午的陰沉，介于

冷和暖之間，我滯留在

有你的磁場里，水杯

熱度，干冷的空氣

不適宜傳遞。想想夢中

那株海棠，花還在枝頭

不曾遠離的默契

臥龍崗院內(nèi)的銀杏樹上

親愛的鴿子，等待著

雪落的消息。我閉上眼

仿佛春就要到來，一場

獲獎的感言。季節(jié)

趨于萌動，愛和你

風吹的夜晚

不羈的風。月亮是夜的

心結(jié)，那只出走的鳥兒

又飛回來。林子里暗藏著

無數(shù)的驚嘆和停頓

巢，卻并不適宜做句號

這就像，你永遠

也不能看清楚的我

沙子在城市里推磨

河流被光陰逐漸剝離

謎底，一切都離得那么遠

荊紫關，土層

呆滯著，我的停頓

走不進你的憂傷

密不透風的籬笆。油菜花

無數(shù)的子彈劃過之后

流星遠去，這個角落

更加凄涼黑暗。和你

隔世的眼淚，他們的墓地

以及低垂著的旌幡

發(fā)絲不愿萎縮，一根

捆綁在陽光上的哭泣

從荊紫關的那個夜晚里

醒來，風掠過石頭的沉默

鐘聲

重疊覆蓋。隱約聽見

鐘聲，迷茫的人決不能

輕易死去，略微衰老

是個別羽毛，障目的

葉子完全可以舍棄

沒有理由去懷疑夢中

的那片雪花，有佳人

在撫弄，花開的聲音

春的咒語就是力量

和勇氣。潮水

泛濫，我沐浴著你

與永偉、江離、羅羽和向威

這首詩繼續(xù)著它的

滑翔?？蛷聂斏皆朴味鴣?/p>

在宛城南關的古宅

青磚，瓦片。車水馬龍里

詩性地存在者，撿起

這漸漸遠去的標簽

與江南對接。賒店的

青花瓷，打開煙雨

紫薇花濃，唐朝的夜幕

貝貝、亞刀、青樹和我

在油田

歲末的暢想 如盤中

堅果，五一路上

我和魔頭，不斷地

嗑出問號、驚嘆號

一地的零落，雪再次

被撕開。撒歡兒的啤酒

充當下午的句號

皇帝又著新裝，你我

誰也不是神筆馬良

這樣的試探，毫無意義

虛和實之間繁生著四季

花開花落。依水的蒼茫

熟悉的孤獨，是我無數(shù)次

都想砍倒的那些樹

酒醒的時候，想起

一個詞語：徒勞

村口的老榆樹剛離開人世

黑烏鴉就開始懷念它

心傷是個無人認領的孩子

楊柳依依

飽滿的陽光，中

楊柳依依。風拂弄

壩堤，等待那個可以

擁你的季節(jié)，雪的冰潔

定會是一種水柔

心越過春天，我們信仰

愛和思念。那團火

燃燒在玫瑰的唇紅里

如冷風吹滅

張牙舞爪。如你的春天

雪韻尚未展開

這個夜晚燃得很節(jié)制

燭光靠近，淅瀝的雨

敲不開眾生的心事

冷風吹滅在文化宮

夜，眼角彈淚

散去的是霧霾

啤酒瓶習慣歪倒

就像總在此時

難眠的你我

落淚

深深的刺痛，稻草人

這不是雪的一部分

2013的元旦

盆窯，河是用筆畫出的記憶體

春答應了夢想

我答應了淚水和憂傷

多情的人啊

歲末感言范文第5篇

開播式安排在我國重要的軌道交通裝備高端產(chǎn)品基地，也是該片推出的唯一一家軌道交通制造企業(yè)――中國北車唐山軌道客車有限責任公司（以下簡稱唐車公司）高速動車組生產(chǎn)線舉行。宏大的廠房里，停放著唐車公司自主研發(fā)的CRH3A動車組、CRH3G動車組、石家莊A型地鐵樣車和出口土耳其的100%低地板現(xiàn)代有軌電車。這些軌道交通裝備新產(chǎn)品，代表著我國軌道裝備制造業(yè)的先進水平。

唐車，一個始建于1881年的百年老廠，何以能領跑世界速度，在新百年的征程上再次煥發(fā)出灼人的青春和活力？唐車公司青年方陣給了我們一個響亮的回答。

用青春托舉高速動車制造技術平臺

“能制造350公里高速動車的三維流線型司機室的，全世界只有空客、西門子和我們唐車三家?！?/p>

來到唐車青年中間，常常能聽到血氣方剛的小伙子、颯爽英姿的大姑娘說出的“該項技術只有我們擁有”、“這方面我們在國際領先”等話語。的確，他們創(chuàng)造了世界軌道交通第一速度，他（她）們有資格自信、自豪。

“靠引進、消化、吸收、再創(chuàng)新，到最終擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，唐車用5年時間走完了國外企業(yè)20年的路，掌握了動車組列車的車體總成、總組裝、調(diào)試等動車組關鍵制造技術?！睘樘岣呒夹g人員和工人水平，形成再創(chuàng)新的能力，構(gòu)建產(chǎn)品持續(xù)發(fā)展的平臺，這些年唐車公司共派出90多個團組、1000多人次參加出國培訓，90%都是35歲以下的青年員工。

唐車公司現(xiàn)有員工6700余人，其中35歲以下青年3800余人，團員2000余人。

立足時速350公里CRH3動車組生產(chǎn)，唐車公司團委按照中央企業(yè)團工委和中國北車集團公司團委實施青年創(chuàng)新創(chuàng)效活動的總體部署，組織青年員工廣泛開展了科技創(chuàng)新、管理創(chuàng)新、操作創(chuàng)新和服務創(chuàng)新活動。近三年來實現(xiàn)科技創(chuàng)新成果100多項，管理創(chuàng)新成果200多項，一線技術工人的操作創(chuàng)新成果近500項。

走進唐車公司的生產(chǎn)現(xiàn)場，隨處都可看到以操作者名字命名的創(chuàng)新操作法指示牌，一張張青年員工的笑臉就象一朵朵盛開的鮮花，在動車組生產(chǎn)線上綻放。

CRH3動車組已經(jīng)達到了每秒近百米的運行速度，近于“陸地飛行”的狀態(tài)，生產(chǎn)中每一個細小的操作失誤，都將對動車組運行產(chǎn)生重大影響，產(chǎn)品質(zhì)量必須要有極為可靠的保證。據(jù)測算，每列CRH3動車組需要使用電纜線達100多種、4萬多根，有8萬多個接頭，連在一起將近400公里，相當于從北京到鄭州的直線距離。

在電線放線、布線和剪線操作中，青年女工劉莉莉自創(chuàng)了適于動車組生產(chǎn)的“劉莉莉剪線法”，匠心獨具地研制了“過線架”、“過線孔細化板”等工裝，保證纜線不沾地、不糾纏，使電線前端破損率降低為零，提高工作效率一倍以上。在接線工序中，劉莉莉創(chuàng)新發(fā)明的“5步接線操作法”，更是保證接線操作實現(xiàn)了“萬根無差錯”的水平。據(jù)統(tǒng)計，CRH3動車組的組裝接線準確率達到了99.997%，創(chuàng)造了同行業(yè)的世界之最。

“世界最先進的動車組上刻著我們的名字！”

“時速350公里運營，世界上沒有經(jīng)驗。所以，哪怕一個小小的螺栓，一塊裙板，一根電線，員工生產(chǎn)的每一個細小操作都必須一絲不茍的按標準進行，并記錄在案。”不到40歲的高級工程師黃烈威說。

青年鋁焊工技師殷麗榮說：“我們焊的動車組，用X光照，也不能找出一個氣泡，100%沒有缺陷。我們每個焊工的鋼印都打在上面?！?/p>

“繼續(xù)努力，專注工作”，這是唐車公司“萬根接線無差錯”第一人高向麗純樸的獲獎感言。高向麗是唐車公司總裝配廠一名青年女工，捋線、核線、接線、剝線……她巧手翻飛，在盤根錯節(jié)的電纜叢林中把‘剪不斷，理還亂’的電纜編織成一副美麗的畫卷。她參與了接線工藝流程的標準化設計，僅從第一列CRH3動車組生產(chǎn)到第14列出廠，就累計完成了10582根接線無差錯，得到公司嘉獎。

華燈初上，完成了一天工作的高向麗把寫有自己名字的作業(yè)牌捆扎在綁好的線纜上，記名作業(yè)牌放上去，就再也不會取下來了，她的名字將和CRH3動車組緊緊綁在一起，飛馳在祖國的大地上。

接軌世界，普通青工同樣能當頂梁柱

要做軌道交通裝備行業(yè)世界級企業(yè)，需要與世界接軌的各種青年人才。

孫斌斌30出頭，別看她年紀輕輕，卻是中國北車資深專家，是唐車公司首批“與世界接軌”的女焊工。這位19歲技校畢業(yè)就進工廠當焊工的姑娘，近年出國培訓多次，全國僅有包括她在內(nèi)的兩人通過歐洲最高級的7項焊接資格認證，具有做“國際焊接教師”的資格，她的200多名學生焊接了世界上運營速度最快的CRH3“和諧號”動車組。