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凝膠色譜法范文第1篇

[關(guān)鍵詞]凝膠色譜法 測定 頭孢美唑鈉 聚合物

中圖分類號：TH23 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-914X（2015）10-0332-01

頭孢美唑鈉是一種半合成抗生素，其屬于第三代頭孢菌素，在臨床治療中有著廣泛的應(yīng)用，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，這一藥物的抗菌性比較強，而且有著良好的藥效。通過測定實驗發(fā)現(xiàn)，為了提高頭孢美唑鈉的藥效，必須控制好其生產(chǎn)的質(zhì)量，控制高分子雜質(zhì)的產(chǎn)生，這樣可以防止患者的服用這一藥物時出現(xiàn)過敏反應(yīng)，還可以降低藥物的毒性，防止藥品醫(yī)療事故的發(fā)生。本文通過建立凝膠色譜法測定頭孢美唑鈉中聚合物的方法，提高了藥品質(zhì)量檢測結(jié)果的可靠性，對藥品生產(chǎn)安全也有著保障作用。

一、儀器與試藥

1、儀器

KGF-02型高分子聚合物測定儀（上海金達生化儀器廠）；WHSOO}JSB伍豪色譜土作站（上海伍豪信息科技有限公司）；色譜柱（40一120 μm葡聚糖凝膠G 10為填料）；玻璃柱（內(nèi)徑1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm） ； BP211 D型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

2、藥品與試劑

頭孢美唑鈉對照品（批號：MZW S0901，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：91.7%）；注射用頭孢美唑鈉（批號：090101，090102，090103深圳立健藥業(yè)股份有限公司）；Naz HPOQ ， NaHz PO、均為分析純；純化水為公司自制；葡聚糖凝膠（Sephadex） G-0、藍色葡聚糖2000（Amersham Bioscience公司）。

二、方法與結(jié)果

1、溶液的制備

1.1對照溶液的制備

實驗人員首先需要稱取適量頭孢美唑鈉原料，然后加入純化水進行溶解，將其制備為1mL溶液含0.2mg頭孢美唑的對照溶液。這一過程主要是定量稀釋，對精確度有著較高的要求。

1.2供試品溶液的制備

采用精密的儀器，稱取0.2g注射用頭孢美唑鈉，然后將其置于10mL的容量瓶中，再加入一定量的純化水進行稀釋，達到規(guī)定的刻度后做搖勻處理。這一過程要求研究人員必須規(guī)范操作。

2、色譜條件

色譜柱為葡聚糖凝膠G-10柱（40一120μm，柱內(nèi)徑1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm）；流動相A為pH7. 0的0. 02 mol/L磷酸鹽緩沖液[0. 02 mol/LNaz HPOQ -0. 02 mol / L NaH2 PO4（體積比61： 39 ） ]，流動相B為純化水；流速為1.5 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣量為200μL。

3、系統(tǒng)適用性試驗

精密稱取藍色葡聚糖2000適量，加純化水定量稀釋成質(zhì)量濃度為0. 1 mg/mL的溶液，精密量取200 μL，注入液相色譜儀，分別以流動相A，B進行測定，記錄色譜圖。按藍色葡聚糖2000峰計算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于700，拖尾因子應(yīng)小于2. 0。在2種流動相系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000的保留時間的比值應(yīng)在0. 93一1. 07之間，對照溶液主峰、供試品溶液中聚合物峰與相應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000峰的保留時間的比值均應(yīng)在0. 93一1. 07之間。稱取注射用頭孢美唑鈉約0. 2 g，置10 mL容量瓶中，用1 mg/mL的藍色葡聚糖2000溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取200μL注入液相色譜儀，用流動相A進行測定，記錄色譜圖。聚合物峰高與單體間，及聚合物之間的谷高比（分離度R）應(yīng)大于2.0。另以流動相B為流動相，精密量取對照溶液200μL，連續(xù)測定5次，峰面積RSD值應(yīng)不大于5. 0% 。見圖1、表1（其中A表示藍色葡聚糖2000在流動相A中，B表示藍色葡聚糖2000在流動相B中，C表示對照溶液在流動相B中，D表示供試品溶液在流動相A中）。

4、注射用頭孢美唑鈉中聚合物的測定

取注射用頭孢美唑鈉約0. 2 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻。立即精密量取200 μL注入液相色譜儀，以流動相A為流動相進行測定，記錄色譜圖。另精密量取對照溶液200 μL注入液相色譜儀，以流動相B為流動相進行測定，記錄色譜圖。

5、定量限的測定

分別取頭孢美唑鈉對照品適量，精密稱定，加水稀釋制成系列質(zhì)量濃度的對照溶液。分別精密量取上述溶液200 μL注入液相色譜儀，以流動相B為流動相依法進行測定，以信噪比10： 1為指標(biāo)，測得定量限為0.034μg/mL。

6、穩(wěn)定性試驗

取同一批注射用頭孢美唑鈉（批號：090101）約0. 2 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別于0，1，2，4 h精密吸取200 μL注入液相色譜儀，以流動相A為流動相進行測定，結(jié)果聚合物峰面積的RSD值為15. 62%，表明供試品溶液中聚合物的峰面積隨放置時一間的延長而增大，因此應(yīng)在供試品溶液配制后立即進樣測定。

三、討論

在不同的酸堿條件下，頭孢菌素發(fā)生聚合反應(yīng)的難易程度不同，一般在強堿與強酸條件下，注射用頭孢美唑鈉較易發(fā)生聚合反應(yīng)，會生成一定量聚合物，本文采用凝膠色譜法對這一聚合物進行了測定，通過分析注射用頭孢美唑鈉的高分子聚合物含量，可以為頭孢美唑鈉的質(zhì)量檢驗提供依據(jù)。由于頭孢菌素在堿性以及酸性條件下會發(fā)生聚合反應(yīng)，所以，在測定的過程中，選用了pH值為7的磷酸鹽緩沖液作為流動相。

分子排阻色譜法是一種有效的藥物檢測方法，其對頭孢高分子雜質(zhì)有著較好的檢測效果。在本次實驗中，由于頭孢美唑鈉高分子聚合物對照品不宜獲取，而且實驗樣品中高聚物的數(shù)量也比較少，為了提高實驗的準(zhǔn)確性，需要在配制檢測分離度時，加入一定量的葡萄糖，這可以增加聚合物峰值面積，加入量的具體數(shù)值可依實際情況穩(wěn)定，要保證聚合物峰面積達到規(guī)定值的2倍左右。通過實驗證明，頭孢美唑鈉聚合物的分離度、拖尾因子以及保留時間符合藥品適用性的要求。本次實驗采用了封閉式凝膠柱，流相的流速達到了1.5mL/min，在洗脫處理后，聚合物既滿足分離的質(zhì)量要求，也提高了分離的效率，縮短了分析時間。

注射用頭孢美唑鈉聚合物的形成具有動態(tài)性，聚合物樣品中高分子雜質(zhì)的數(shù)量與溶液放置的時間有著較大關(guān)系，一般放置的時間越長，聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，所以，為了保證測定的準(zhǔn)確性，研究人員需要掌握好時間，這樣才能提高測定結(jié)果的可靠性。當(dāng)供試品溶液配制中得到聚合物后，一定要及時測定。另外，在測定的過程中，測定方法的選用需要參考《中國藥典》的 相關(guān)檢測要求，一定要考慮高分子雜質(zhì)的影響。本次試驗與研究表明：凝膠色譜法測定注射用頭孢美唑鈉聚合物，具有操作簡單、靈敏度高、可控性強等優(yōu)點，可以有效提高頭孢美唑鈉聚合物的質(zhì)量控制水平。

參考文獻

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凝膠色譜法范文第2篇

植物油是人類生活的必需消費品，其質(zhì)量安全直接關(guān)系到消費者的身體健康。我國規(guī)定了棉籽油、花生油、大豆油及菜籽油中擬除蟲菊酯類和有機磷類農(nóng)藥的殘留限量（005～05 mg/kg）＼[1＼]。目前，對于植物油的農(nóng)藥多殘留檢測前處理方法主要是采用液液萃?。↙LE）＼[2＼]，結(jié)合固相萃?。⊿PE）＼[3，4＼]，凝膠色譜（GPC）＼[5＼]或基質(zhì)固相分散（MSPD）＼[6＼]進行。隨著前處理技術(shù)的發(fā)展，新的前處理技術(shù)被應(yīng)用到植物油中農(nóng)藥殘留的檢測中，如在線GPC系統(tǒng)＼[7，8＼]及QuEChERS法＼[9～12＼]。這類方法的出現(xiàn)，使得樣品前處理變得簡單，有時甚至不需進行前處理。但也存在如基質(zhì)干擾較嚴(yán)重＼[7，8＼]、檢出限偏高＼[7＼]、處理時間長＼[9～12＼]等問題。

本研究將QuEChERS方法結(jié)合在線GPCGCMS系統(tǒng)用于檢測植物油中的多農(nóng)藥殘留，將毒鼠強以及多種中高毒農(nóng)藥納入到研究范圍，與已報道的方法＼[9～13＼]相比，采用QuEChERS法處理樣品時不需調(diào)節(jié)pH值，無需進行冷凍除脂，且所需樣品量少，進一步減小溶劑消耗； 在線GPCGCMS系統(tǒng)中的GPC部分可以很好地彌補QuEChERS法去除干擾物質(zhì)不徹底的問題，利用大體積進樣（LVI）技術(shù)，可將GCMS的靈敏度進一步提高，而且能夠抑制部分基質(zhì)效應(yīng)。本方法具有較高的靈敏度及精密度，較低的分析成本，可用于葵花油、大豆油和玉米油中34種農(nóng)藥殘留快速篩查與檢測。

23實驗方法

對濃度為100 mg/L的13種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（甲拌磷、地蟲硫磷、治螟磷、苯線磷、甲基對硫磷、對硫磷、特丁硫磷、乙基嘧啶磷、蠅毒磷、狄氏劑、異狄氏劑、克百威、氟蟲腈等）各2支，毒鼠強取用1支，全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。對20種農(nóng)藥固體標(biāo)準(zhǔn)品（久效磷、殺螟硫磷、甲胺磷、氯唑磷、丁基嘧啶磷、亞胺硫磷、乙硫磷、殺撲磷、甲基立枯磷、伏殺磷、丙溴磷、乙拌磷、丙線磷、三氯殺螨醇、林丹、氰戊菊酯、p，p滴滴滴、p，p滴滴伊、o，p滴滴涕、p，p滴滴涕）每種稱取10 mg，加入到10 mL容量瓶中，先用少量丙酮溶解，然后用正己烷定容， 配制成質(zhì)量濃度均為1000 mg/L的儲備液，吸取200 μL儲備液轉(zhuǎn)移到同一50 mL容量瓶中本研究采用氟胺氰菊酯和滅螨猛校準(zhǔn)混合物（10 mg/L）進行時間定位（大多數(shù)農(nóng)藥分子量介于氟胺氰菊酯和滅螨猛之間），在22節(jié)GPC條件下，氟胺氰菊酯和滅螨猛保留時間相差小于2 min（圖1）。本研究收集340～540 min餾分到200 μL定量環(huán)中，使得34種農(nóng)藥完全進入GCMS系統(tǒng)中進行分析檢測。其它餾分由GPC排到系統(tǒng)外，由此可使樣品中的雜質(zhì)進一步去除，進而減小基質(zhì)效應(yīng)、降低分析背景、改善色譜峰形，且GPC系統(tǒng)克服了常規(guī) GPC消耗溶劑量大、自動化差、操作繁瑣等問題。

GPC系統(tǒng)與GCMS系統(tǒng)采用程序升溫大體積進樣口連接（PTVLVI），利用大體積進樣技術(shù)，可將GCMS的靈敏度進一步提高， PTVLVI技術(shù)可以快速的加熱或者冷卻，減少熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的分解，且較高的載氣流速可以減少目標(biāo)分析物在襯管中的停留時間，在一定程度上抑制基質(zhì)效應(yīng)。

32萃取劑及萃取方式的選擇

按24節(jié)處理步驟，在3支10 mL玻璃試管中各加入040 g葵花油樣品，并按01 μg/g加入標(biāo)準(zhǔn)溶液。比較了乙腈丙酮（1∶1， V/V）、正己烷飽和的乙腈及乙腈3種萃取劑的萃取效率。樣品經(jīng)不同萃取劑萃取后的凈化效果見圖2。結(jié)果表明，采用乙腈丙酮（1∶1， V/V）萃取時基質(zhì)干擾嚴(yán)重，不適合作為此方法的萃取劑；

34基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是農(nóng)藥分析需要考慮的問題＼[18＼]。本研究在采用純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)曲線進行定量時，除甲胺磷、治螟磷、林丹、氯唑磷、丁基嘧啶磷、甲基立枯磷、乙基嘧啶磷，其余24種農(nóng)藥（除p，p′DDE， p，p′DDD， p，p′DDT）均有不同程度的基質(zhì)增強效應(yīng)。采用歐盟DG SANCO＼[15＼]中的規(guī)定，利用不含農(nóng)藥的空白基質(zhì)匹配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，使之達到與樣品中農(nóng)藥同等的響應(yīng)。

4結(jié)論

本實驗采用QuEChERS方法對葵花油樣品前處理方法進行了優(yōu)化，結(jié)合GPCGCMS建立了一套可同時測定葵花油、大豆油和玉米油中31種 （不包括p，p′DDE， p，p′DDD， p，p′DDT） 中高毒農(nóng)藥的快速篩查方法，檢出限、定量限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足農(nóng)藥多殘留檢測方法的要求， p，p′DDE， p，p′DDD， p，p′DDT滿足定性要求。采用QuEChERS法結(jié)合GPCGCMS在線聯(lián)用，一方面GPC系統(tǒng)彌補了QuEChERS前處理方法去干擾物質(zhì)不徹底的問題，提高了方法的靈敏度、分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，且在線GPC系統(tǒng)從進樣到完成色譜柱沖洗僅需要使用10 mL有機溶劑，符合綠色化學(xué)的理念； 另一方面，采用QuEChERS法進行樣品前處理，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 27632012

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凝膠色譜法范文第3篇

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法 發(fā)展 優(yōu)勢 劣勢 發(fā)展 應(yīng)用

高效液相色譜法使用的流動相是液體，應(yīng)用高壓輸液裝置，將具有不同極性的單一溶劑或者不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相壓進裝有固定相的色譜柱中，各種成分在柱內(nèi)分離以后，然后進入檢測器被檢驗，最后對試樣進行分析。

一、高效液相色譜法的發(fā)展

1.高效液相色譜法的歷史

色譜分析法的一個分支就是高效液相色譜法，在20世紀(jì)60年代末期，以氣相色譜法和經(jīng)典液相色譜發(fā)為基礎(chǔ)，形成的一種新的分離和分析技術(shù)。到了1960年，隨著氣相色譜法理論和實踐的不斷發(fā)展，同時光學(xué)、機械、電子等技術(shù)也在不斷發(fā)展，液相色譜法逐漸被相關(guān)學(xué)者使用。到了20世紀(jì)60年代末，高效液相色譜發(fā)就應(yīng)用高壓泵和化學(xué)鍵合固定相。

2.高效液相色譜法和其他色譜法的比較

2.1高效液相色譜法和經(jīng)典液相色譜的比較

經(jīng)典液相色譜法使用的是粗粒多孔固定相，將固定相裝在口徑大、較長的玻璃柱管內(nèi)，流動相只能通過重力流過色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)和擴散的速度都很慢，因為柱的入口壓力很小，導(dǎo)致柱子的效果很差，在很大程度上增加了分析時間。而高效液相色譜法使用的固定相是全多孔微粒，將固定相裝在口徑小、短的不銹鋼的柱子內(nèi)，流動相通過高壓輸液泵進入了柱壓很大的色譜柱中，在固定相中，溶質(zhì)的傳質(zhì)和擴散速度都很快，所以在很多的時間內(nèi)，柱子的效率和分離能力都很好。

2.2和氣象色譜法的比較

高效液相色譜法和氣象色譜法相比有很多的類似之處。氣象色譜法的選擇性很高、分析效率也不低，同時還具有很高的靈敏度和分析速度，可是這種分析方法只能對那些蒸氣壓低和沸點低的樣品進行分析，對于那些高沸點的有機物、具有不高穩(wěn)定性的化合物、高分子物質(zhì)和生物活性物質(zhì)來說，這種方法就行不通了。經(jīng)過分析，只有20%的有機化合物可以使用氣象色譜法進行分析?？墒菍Ω咝б合嗌V法來說，就能分離和分析剩余的80%的有機化合物。

二、高效液相色譜法的綜合分析

1.高效液相色譜法的有適合劣勢

高效液相色譜法和其它分析方法相比具有很高的分辨率，為了達到最佳的分離效果可以選擇流動相和固定相；同時它的分析速度很快，一般只需要幾分鐘或者即使分鐘；它還具有很高的重復(fù)性，使用的樣品還可以回收；它使用的色譜柱還可以重復(fù)使用，非常環(huán)保；具有較高的自動化程度，在進行分析時，分析的精確度也很高。所以高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用，尤其是對大部分的有機化合物進行分離和分析，在分離和分析高沸點、極性強、大分子、熱穩(wěn)定差的化合物時有很大的優(yōu)勢。

可是高效液相色譜法需要很高的壓力，一般要達到150～350×102 KPa。同時如果流動相的配比在進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等發(fā)生任何變化，或者被分離的物質(zhì)發(fā)生擴散或者滯留的現(xiàn)象都會加寬色譜峰，降低柱效率。

2.對高效液相色譜法的分類

由于分離機制不同，高效液相色譜法可分為以下幾類。（1）吸附色譜。這種方法的固定相是固體吸附劑，流動相是不同極性溶劑，根據(jù)各個組分在吸附劑上的吸附能力不同對其進行分離。（2）分配色譜。這種方法的固定相是液體。因為每一個組分在固定相中的溶解能力不同，對試樣中的組分進行分離。（3）親和色譜。這種方法主要是對固定相的結(jié)合特性進行利用，然后將分子分離。親和色譜在凝膠過濾色譜柱上連接和有待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合能力的分子，同時這種結(jié)合是可逆的，在對流動條件進行改變時，也能對其進行分離。（4）離子交換色譜。這種色譜的固定相是離子交換劑，將離子交換樹脂上可電離的離子和流動相中的具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，因為這些離子和交換劑的親和能力不同，就會分離開來。（5）體積排阻色譜。這種色譜的固定相是具有化學(xué)惰性的多孔性凝膠，固定相對各組分的體積阻滯作用不同，這樣各組分就會發(fā)生分離。因為流動相的不同又可分為凝膠過濾色譜和凝膠滲透色譜。

三、高效液相色譜法的應(yīng)用

1.高效液相色譜法的應(yīng)用范圍

對于那些高沸點不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的、高分子的、具有不同極性餓有機化合物，生物活性物質(zhì)和各種天然的物質(zhì)，高效液相色譜法都能對其進行分離和分析。這些物質(zhì)在食品、合成藥物、石油化工產(chǎn)品、生物化工產(chǎn)品等方面都有應(yīng)用，其中在這些方面應(yīng)用的無機物中占20%，在這些方面應(yīng)用的有機物中占80%，特別是那些永久性氣體、易揮發(fā)的、具有中等分子量的化合物都能進行分析。

2.高效液相色譜法應(yīng)用的限制

首先高效液相色譜法使用的流動相是多種溶劑，同時使用這種方法進行分析需要的成本比氣象色譜法高，對環(huán)境也會產(chǎn)生污染。特別是在進行不同濃度的操作時，還要對其進行洗脫，操作起來比氣象色譜法復(fù)雜。同時，這種方法使用的檢測器不是通用的，和氣象色譜相比就處于劣勢了?？墒沁@幾年蒸發(fā)激光散射檢測器逐漸被應(yīng)用，很有可能成為高效液相色譜法分析時一種通用的檢測器。還有就是，高效液相色譜法是不可能取代氣象色譜法的，因為對于組成復(fù)雜、具有多種沸程的石油產(chǎn)品來說，它需要柱效達到10萬塊塔板和毛細(xì)管氣相分析發(fā)分析。最后，這種方法也無法取代中、低壓柱色譜法。在柱壓從200千帕升到到1兆帕?xí)r，具有生化活性的生化樣品收到壓力容易分解、變性。

四、結(jié)束語

高效液相色譜法是在氣象色譜和液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展的，同時發(fā)展也很快，因為這種方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確、效率高，當(dāng)前，在各個方面的應(yīng)用也非常廣泛。可是這種方法也有缺陷，所以要不斷的對其進行完善，使其變得更加快捷精準(zhǔn)。

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凝膠色譜法范文第4篇

血紅蛋白的提取和分離一般步驟為樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。

1　樣品處理

1.1　紅細(xì)胞的洗滌

洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時采用低速短時間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復(fù)洗滌3次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。

1.2　血紅蛋白的釋放

在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白，加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。

2　粗分離

2.1　分離血紅蛋白溶液

將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第1層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

2.2　透析

取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol／L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)。

3　純化

利用凝膠色譜柱可對血紅蛋白進行純化(圖1)。

4　純度鑒定

使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

5　血紅蛋白的提取和分離操作問題分析

5.1　血紅蛋白的提取

紅細(xì)胞分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少，未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。

5.2　檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功的方法

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

5.3　凝膠的裝填標(biāo)準(zhǔn)：緊密、均勻

如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)形成無數(shù)的空隙，使本該進入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，擾亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。

5.4　沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的

這樣操作不但節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物，排除凝膠內(nèi)的空氣。

5.5　G--75

“G”代表凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。

5.6　裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的

此操作的目的是使凝膠裝填緊密。

5.7　實驗過程加入檸檬酸鈉

加入檸檬酸鈉的目的是防止血液凝固；低速、短時離心防止白細(xì)胞沉淀；緩慢攪拌防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。

5.8　檢測血紅蛋白的分離是否成功的方法

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。

6　典型例題

【例1】在血紅蛋白的提取和分離實驗中，下列操作正確的是( )

A　分離紅細(xì)胞時需去除上層透明的黃色血漿

B　紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白時只需加入蒸餾水

C　分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心

D　洗脫時，待紅色蛋白質(zhì)下移即開始收集流出液

思維啟導(dǎo)：紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白除需加入蒸餾水，還需加入40％體積的甲苯；分離血紅蛋白溶液是高速長時間離心；洗脫時，待紅色蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。

參考答案：A。

【例2】下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程序，敘述錯誤的是( )

A　樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液

B　通過透析可能去除樣品中相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取

C　可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化

D　可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度

思維啟導(dǎo)：首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定，由此可知B的敘述錯誤。由玻璃紙制成的透析袋能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內(nèi)，透析可以去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。

參考答案：B。

【例3】紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題：

(1)實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。

①加入檸檬酸鈉的目的是___________。

②以上所述的過程即是樣品處理，它包括__________、_________、收集血紅蛋白溶液。

(2)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。

①透析的目的是

②透析的原理是

(3)然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。

①樣品純化的目的是__________。

②血紅蛋白有什么特點?

這一特點對進行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?

思維啟導(dǎo)：檸檬酸鈉是一種抗凝劑，能夠防止血液凝固。凝膠色譜柱中如果產(chǎn)生了氣泡，氣泡就會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。

參考答案：

(1)①防止血液凝固

②紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放

(2)①去除分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)

②透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內(nèi)

(3)①通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去

凝膠色譜法范文第5篇

關(guān)鍵詞：凝膠劑 歐前胡素 高效液相色譜法

中圖分類號：R286 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）06（a）-0214-02

Determination of Imperatorin in Xiaoyantong Gel

ZHU Yanhua WANG Xinggan GUO Xin YAN Xueying

（Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang，150040）

Abstract：Objective：To establish a HPLC method for determination of imperatorin in Xiaoyantong gel.Methods：Mobile phase was methanol-water（55：45）.Detection wavelength：300nm.Flow rate：1.0mL min-1.Column temperature：30℃.Results：The content of imperatorin is determined by this method，while the linear relation was good.The average recovery was 99.53%.The RSD was 1.82%.Conclusions：This method is simple，accurate and can be used for determination of Xiaoyantong gel.

Key words：Gel Imperatorin HPLC

消炎痛凝膠劑是由白芷浸膏、薄荷腦等藥組成。具有消炎止痛的功效，臨床上主要用于治療肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、腰腿痛、跌打損傷及網(wǎng)球肘引起的腫痛。為了有效控制消炎痛凝膠劑的質(zhì)量，參考相關(guān)文獻[1-4]采用高效液相色譜法建立了其主要藥味白芷中歐前胡素的含量測定方法，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（LC-2010 AHT，日本島津公司）；消炎痛凝膠劑（自制，批號：20130912、20130913、20130914、20130915、20130916）；歐前胡素對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號： 110826-201013）；甲醇為色譜純；水為超純水；其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

色譜柱：（250 nm×4.6 nm，5 ?m）；流動相：甲醇-水（55∶45）；檢測波長：300 nm；流速：1.0 mL?min-1；柱溫：30 ℃；理論塔板數(shù)不得低于2000。

2.2 對照品溶液的制備

取歐前胡素對照品，加甲醇制成每1 mL含100 ?g的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取凝膠劑約1g，精密稱定，置具塞玻璃試管中，加0.1 mol?L-1鹽酸0.1 mL，用甲醇定容至刻度，超聲30 min，取出后補加甲醇至刻度，用0.45 ?m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品的溶液。

2.4 陰性溶液的制備

按處方比例稱取除白芷浸膏外的其他藥物，按照供試品溶液的制備方法制備陰性供試品溶液。

2.5 干擾試驗

照上述色譜條件，分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，歐前胡素對照品、供試品在9 min左右出現(xiàn)吸收峰，陰性樣品無干擾。

2.6 線性關(guān)系考察

吸取歐前胡素對照品溶液，加入甲醇制備成濃度分別為0.8、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg?mL-1的溶液。分別進樣10 ?L，以進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行回歸處理得回歸方程：A=1.6×105C-14356，R2=0.9995，表明歐前胡素在0.8～16 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取消炎痛凝膠劑（批號：20130912）按2.3項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，照上述色譜條件，分別在第0、12、24、36、48、60、72 h進樣，每個時間點進樣3次，測得峰面積積分值，RSD為2.2%。結(jié)果表明供試液在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 精密度試驗

取本品（批號：20130912）按2.3項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液液10 μL，進樣6次，分別記錄峰面積積分值，RSD為1.9%。結(jié)果表明此方法的日內(nèi)精密度良好，符合含量測定的要求。

2.9 重復(fù)性試驗

取本品（批號：20130912）按2.3項下供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，照上述色譜條件重復(fù)測定3次，結(jié)果表明該法測定歐前胡素含量重復(fù)性良好，RSD為1.57%。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量的本品（批號：20130912）9份，每份約0.1g精密加入歐前胡素對照品1 mL，濃度分別為12 ?g?mL-1、10 ?g?mL-1、8 ?g?mL-1，每個濃度三份，按2.3項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，進行含量測定，并計算回收率。結(jié)果平均回收率為99.53%；RSD為1.82%，加樣回收率符合要求，表明該方法準(zhǔn)確。

2.11 樣品的測定

按2.3項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，取供試品溶液和對照品溶液，分別進樣，測定5批樣品中異歐前胡素的含量，結(jié)果平均含量為0.1692 mg?g-1，RSD為0.18%（表1）。

3 討論

3.1 流動相的選擇

通過對乙腈-水，甲醇-水等多個流動相系統(tǒng)，以及甲醇-水的多個比例進行了考察，結(jié)果表明甲醇-水（55∶45）系統(tǒng)作為流動相，供試品色譜圖中歐前胡素與其它峰能夠達到很好的分離。因此選擇該系統(tǒng)作為流動相。

3.2 提取溶劑的選擇

試驗中曾經(jīng)選用丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇進行提取，結(jié)果以甲醇提取測得的含量較高且分離度好，乙醇提取測得的含量雖高，但有一些雜質(zhì)峰的分離不好，故選用甲醇作為樣品前處理溶劑。

3.3 超聲提取時間選擇

研究比較了超聲提取10、20、30、40 min，結(jié)果表明超聲30 min歐前胡素提取率高于10、20 min，并與40 min提取率基本相同，故本試驗采取了超聲30 min的方法。

參考文獻

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