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干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文第1篇

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；脂肪組織；細(xì)胞培養(yǎng)；SUI模型

【中圖分類號(hào)】R691【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2009)10-0125-01

壓力性尿失禁(SUI)為女性的常見(jiàn)病和多發(fā)病，其發(fā)病率約為1 S%-6O%，多發(fā)生于老年人，因受經(jīng)濟(jì)、宗教、教育程度等因素的影響，其實(shí)際發(fā)生率比統(tǒng)計(jì)發(fā)病率更高。SVl的癥狀嚴(yán)重與否都不自接危及生命，但它給患者的日常上作、生活及社交活動(dòng)造成一定程度的影響，甚至?xí)?yán)重影響患者的生活質(zhì)量乃至家庭和睦。

1臨床資料

注射療法是將藥物、化學(xué)制劑或自體組織等注入后尿道或膀肌頸內(nèi)口粘膜下，使尿道腔變窄、拉長(zhǎng)，延長(zhǎng)功能性尿道的長(zhǎng)度，提高尿道阻力，起到關(guān)閉尿道內(nèi)口和后尿道的作用，從而達(dá)到有效控制排尿的口的。這一治療方法對(duì)尿道內(nèi)括約肌功能障礙、尿道內(nèi)壓降低同時(shí)尿道、膀肌無(wú)其他病變等壓力性尿失禁患者有較好的效果。注射療法主要優(yōu)點(diǎn)在于.以在局部浸潤(rùn)麻醉下進(jìn)行操作，大多數(shù)患者的手術(shù)均.IJ.以在門診進(jìn)行，適用于老年及不能耐一受大手術(shù)的患者。口前注射療法的研究主要集中在選擇不同的注射材料上，理想的注射材料應(yīng)該在結(jié)構(gòu)上完整，無(wú)毒、無(wú)免疫原性、無(wú)變應(yīng)原性，近期內(nèi)不會(huì)被分解，能長(zhǎng)時(shí)間保持其支撐作用?？谇笆褂玫牟牧仙须y達(dá)到上述要求，因此尋找一種取材方便、生物相容性好、安全無(wú)毒、療效滿意的注射材料十分必要。

方法：無(wú)菌技術(shù)下獲取SD大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)脂肪墊，消化離心，長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法獲取脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定其表面分子標(biāo)志。SD大鼠24只分為3組，實(shí)驗(yàn)組（6只），對(duì)照組一（3只），對(duì)照組二（3只）。分別獲取自體ADSCs，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行熒光標(biāo)記。然后實(shí)驗(yàn)組將熒光標(biāo)記的ADSCs自體移植至尿道周圍，對(duì)照組移植未并取尿道組織進(jìn)行HE染色組織學(xué)分析。

2結(jié)果

原代培養(yǎng)顯示培養(yǎng)的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞2d左右開(kāi)始壁,10d-14d左右可達(dá)90%融合,基本上為梭形成纖維樣細(xì)胞形態(tài),免疫細(xì)胞化學(xué)示 CD29陽(yáng)性，CD34陰性。神經(jīng)切斷術(shù)后10天，除模型組和對(duì)照組一各有1只大鼠死亡外，均進(jìn)行尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，三組手術(shù)前后ALLP分別為：對(duì)照組一為27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，對(duì)照二為29.5±4.9和27.4±72.3,模型組為24.8±3.8和14.7±3.0。模型組手術(shù)后ALLP明顯降低，且組織學(xué)檢查亦證明模型組大鼠尿道周圍括約肌明顯萎縮。

3討論

本實(shí)驗(yàn)將熒光金標(biāo)記的脂肪源性干細(xì)胞自體移植至大鼠的近端尿道周圍，行冰凍切片，組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察.見(jiàn)熒光標(biāo)記的細(xì)胞呈金黃色:后取組抗體免疫移植部位有較多的Desmin陽(yáng)性的細(xì)胞，棕黃色，部分出現(xiàn)一定的方向性，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明己有細(xì)胞在局部存活并生長(zhǎng)，提示能成為壓力性尿失禁注射治療的一種理想的注射材料，為將來(lái)進(jìn)行細(xì)胞移植治療壓力性尿失禁提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)論：①大鼠脂肪組織中含有豐富的多能干細(xì)胞。利用消化離心，長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法可獲取大量的干細(xì)胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周圍成活并生長(zhǎng)分化。

參考文獻(xiàn)

[1]梁月有.診斷女性壓力性尿失禁的相關(guān)檢查[J].新醫(yī)學(xué).2006,37（10）:687-689.

[2]王萌.尿道周圍注射治療女性壓力性尿失禁的研究進(jìn)展[J].國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志,2006,26（6）：798-802.

[3]姚啟盛，葉章群，陳從波,等.骨胳肌肌源細(xì)胞自體移植在壓力性尿失禁治療中的價(jià)值[J].中華泌尿外科雜志，2006，26（12）:841-843.

干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文第2篇

關(guān)鍵詞：信息技術(shù)；婦幼保健院；政工干部培養(yǎng)

信息技術(shù)是伴隨計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展的，如今信息技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入了發(fā)展的全盛時(shí)期，信息技術(shù)的發(fā)展對(duì)人們的生活、學(xué)習(xí)及工作方式產(chǎn)生了廣泛而深刻的影響。在此背景之下，政工干部的培養(yǎng)工作也不免受到信息技術(shù)發(fā)展的影響，如何準(zhǔn)確地把握信息技術(shù)發(fā)展水平及趨勢(shì)對(duì)于政工干部培養(yǎng)產(chǎn)生的影響，科學(xué)利用信息技術(shù)的強(qiáng)大功能來(lái)提高政工干部培養(yǎng)的質(zhì)量，是所有企事業(yè)單位需要思考的問(wèn)題，婦幼保健院也不例外。

一、信息技術(shù)發(fā)展對(duì)婦幼保健院政工干部培養(yǎng)的影響

1.信息技術(shù)發(fā)展對(duì)政工干部素質(zhì)提出了更高的要求

信息技術(shù)的發(fā)展使得信息化素質(zhì)成為政工干部的基本素質(zhì)之一，婦幼保健院的政工干部也不例外。信息化素質(zhì)是指主體所擁有的各種信息品質(zhì)，包括信息智慧、信息道德、信息意識(shí)、信息覺(jué)悟、信息潛能和信息心理等內(nèi)容。信息化素質(zhì)能讓政工干部跟上時(shí)展的潮流，掌握最新的信息技術(shù)，也能讓政工干部認(rèn)識(shí)到信息的重要性而自覺(jué)地利用信息提高工作質(zhì)量，培養(yǎng)政工干部終身學(xué)習(xí)意識(shí)。婦幼保健院作為醫(yī)療體系的一部分，一些醫(yī)療技術(shù)和醫(yī)療設(shè)備更新速度很快，政工干部必須具備較高的信息化素質(zhì)才能捕捉到這些信息。具體來(lái)說(shuō)，信息技術(shù)的發(fā)展要求婦幼保健院的政工干部全面提高自身素質(zhì)，學(xué)好信息知識(shí)、掌握信息技能的同時(shí)，還要學(xué)習(xí)政工理論知識(shí)、醫(yī)療專業(yè)知識(shí)及人文社科知識(shí)等，培養(yǎng)政工干部的領(lǐng)導(dǎo)管理能力、溝通交流能力等。

2.信息技術(shù)發(fā)展對(duì)政工干部素質(zhì)培養(yǎng)提供了新的條件

信息技術(shù)的發(fā)展改變了傳統(tǒng)的信息的載體形式，拓寬了信息傳播的渠道，極大地縮短了信息傳播所需要的時(shí)間，使個(gè)人獲得信息的成本大大降低，為政工干部的培養(yǎng)創(chuàng)造了有利的條件。首先，政工干部學(xué)習(xí)、溝通渠道更廣。婦幼保健院可以在政工干部的培養(yǎng)課程中使用各種計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)方式，它使課程內(nèi)容更加生動(dòng)有趣，能更好地激發(fā)政工干部的學(xué)習(xí)興趣；依靠網(wǎng)絡(luò)教學(xué)的方式還可以讓政工干部充分利用網(wǎng)上豐富的信息資源，相互交流學(xué)習(xí)；此外政工干部還可以合理安排自己的學(xué)習(xí)時(shí)間，選擇自己的學(xué)習(xí)方式，培養(yǎng)方式更加個(gè)性化。其次，政工干部利用信息的方式發(fā)生了改變。過(guò)去婦幼保健院的政工干部獲取信息主要靠閱讀各種紙質(zhì)材料，現(xiàn)在政工干部閱讀的載體擴(kuò)展到網(wǎng)絡(luò)信息，從文字?jǐn)U展到圖像、聲音、三維等；在表達(dá)方式上實(shí)現(xiàn)了從直接手寫到鍵盤輸入、掃描等，包括直接復(fù)制或者刪減其他文件；在計(jì)算方式上也不再需要人工計(jì)算，利用計(jì)算機(jī)準(zhǔn)確又迅速減輕了政工干部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的負(fù)擔(dān)。

3.信息技術(shù)發(fā)展對(duì)政工干部素質(zhì)培養(yǎng)帶來(lái)的問(wèn)題

首先，信息鴻溝現(xiàn)象比較嚴(yán)重。在婦幼保健院的政工部門中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用現(xiàn)代信息技術(shù)方面也存在較大差異，這給政工干部的信息培養(yǎng)課程增加了不小的難度。其次，網(wǎng)絡(luò)信息量過(guò)于龐大。信息技術(shù)的發(fā)展使得，各種信息都能在網(wǎng)絡(luò)上迅速傳播，過(guò)量的信息會(huì)使人們很難找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是嚴(yán)重影響政工干部的培養(yǎng)工作。

二、提高婦幼保健院政工干部培養(yǎng)質(zhì)量的對(duì)策

1.定期完善政工干部培養(yǎng)方案

信息技術(shù)的發(fā)展變化是日新月異的，婦幼保健院要保證政工干部的培養(yǎng)緊跟時(shí)代的步伐就必須根據(jù)時(shí)代的變化對(duì)培養(yǎng)方案和教學(xué)計(jì)劃進(jìn)行全面的調(diào)整和修訂，但是不能改變的是要始終強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)信息化素質(zhì)的重要性。培養(yǎng)方案的完善和修改可以從以下幾方面入手：教學(xué)目標(biāo)、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)課程專題、教師師資、教學(xué)材料和教學(xué)組織形式等，要突出強(qiáng)調(diào)信息化素質(zhì)的地位。

2.精心設(shè)計(jì)培養(yǎng)的專題體系

婦幼保健院政工干部培養(yǎng)的基本平臺(tái)就是課程專題，怎樣設(shè)計(jì)合理的課程專題也成為政工干部培養(yǎng)工作的難題，可以明確的是必須要依據(jù)信息技術(shù)的發(fā)展對(duì)各類政工干部知識(shí)能力素質(zhì)的客觀要求來(lái)建立課程專題體系，同時(shí)也要根據(jù)不同教學(xué)對(duì)象的性質(zhì)、層次和類型做出調(diào)整。要根據(jù)政工干部的培養(yǎng)目標(biāo)確定專題的類別和課時(shí)比例，各類專題都有圍繞解決新時(shí)期思想政治教育工作來(lái)設(shè)計(jì)，專題設(shè)置和內(nèi)容都要做到內(nèi)容精干、素材新穎、實(shí)在管用，不僅要包括信息化知識(shí)和技術(shù)的課程，還要有其他方面的課題。

3.打造政工干部培養(yǎng)的環(huán)境條件保障體系

婦幼保健院可以從以下幾個(gè)方面來(lái)支持政工部門的信息化工作。首先，配置完備的教學(xué)設(shè)施設(shè)備，包括計(jì)算機(jī)及網(wǎng)絡(luò)、多功能教室等。其次，建設(shè)多樣的信息化教學(xué)信息資源子系統(tǒng)，例如數(shù)字化圖書館信息資源、課程網(wǎng)絡(luò)信息資源、教學(xué)管理信息資源等。

總之，為了讓信息技術(shù)的發(fā)展更好地為婦幼保健院的政工干部培養(yǎng)工作服務(wù)，需要站在全局的高度將信息技術(shù)理論和方法應(yīng)用到培養(yǎng)的全過(guò)程中，需要對(duì)政工干部培養(yǎng)的形式、內(nèi)容、方法進(jìn)行深刻變革，以提高政工干部培養(yǎng)的效率，全面提高政工干部信息化素質(zhì)培養(yǎng)的質(zhì)量和效益。

參考文獻(xiàn)：

[1]周軍、夏婷婷，論信息技術(shù)發(fā)展對(duì)政工干部培養(yǎng)影響及其對(duì)策，中國(guó)信息界，2012（05）

[2]梁晨，努力提高政工干部的信息素質(zhì)，經(jīng)濟(jì)研究導(dǎo)刊，2010（08）

干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文第3篇

2010年諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予英國(guó)生理學(xué)家羅伯特•愛(ài)德華茲，以表彰他在“體外受精”技術(shù)領(lǐng)域做出的開(kāi)創(chuàng)性貢獻(xiàn)。

1978年，羅伯特•愛(ài)德華教授和同事一起成功地使第一例試管嬰兒誕生，從此開(kāi)創(chuàng)了生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新紀(jì)元。試管嬰兒在20多年前也曾被世界輿論界視為洪水猛獸而大加抨擊，但時(shí)至今日，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被全世界絕大多數(shù)國(guó)家承認(rèn)，堪稱醫(yī)學(xué)史上的一大奇跡。迄今為止，全球已有上百萬(wàn)試管嬰兒誕生。

被譽(yù)為“試管嬰兒之父”的英國(guó)劍橋大學(xué)教授羅伯特•愛(ài)德華說(shuō)：“克隆單純從技術(shù)上講非常簡(jiǎn)單，就是把卵細(xì)胞中DNA去掉，然后將體細(xì)胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個(gè)試管嬰兒實(shí)驗(yàn)室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險(xiǎn)。”

本文以此熱點(diǎn)問(wèn)題作為命題材料，對(duì)2011年高考生物試題進(jìn)行單項(xiàng)預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)材料及其涉及的知識(shí)、試題如下：

1．試管嬰兒

【知識(shí)鏈接】要做好有關(guān)“試管嬰兒”的試題，除了書本上的知識(shí)外，還要掌握“試管嬰兒”技術(shù)的有關(guān)知識(shí)。“試管嬰兒”技術(shù)是通過(guò)將不孕夫婦的和卵細(xì)胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養(yǎng)使其發(fā)育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內(nèi)使其發(fā)育成胎兒。

體外受精步驟包括：的采集與培養(yǎng)、卵母細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)、體外受精等操作技術(shù)。具體過(guò)程如下圖:

哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的過(guò)程大體概括如下圖：

例1 下列關(guān)于關(guān)試管嬰兒的說(shuō)法，不正確的是（）

A. 從良種母牛體內(nèi)采集的卵母細(xì)胞都需要進(jìn)行體外培養(yǎng)

B. 從良種公牛采集的需進(jìn)行獲能處理

C. 早期胚胎移植的意義在于提高優(yōu)良母畜的繁殖率

D. 早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至原腸胚時(shí)期的胚

解析：本題考查了試管嬰兒的相關(guān)知識(shí)。根據(jù)體外受精和胚胎發(fā)育過(guò)程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至囊胚時(shí)的胚。

答案：D

例2 據(jù)2008年1月17日《干細(xì)胞》雜志報(bào)道，某科學(xué)家使用了進(jìn)行試管受精的年輕女性捐獻(xiàn)的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細(xì)胞，成功克隆出了5個(gè)人體胚胎，進(jìn)而可以開(kāi)發(fā)出有研究?jī)r(jià)值的干細(xì)胞。請(qǐng)回答：

（1）上述過(guò)程中主要應(yīng)用到的兩項(xiàng)動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)為；若將某經(jīng)過(guò)修飾的基因?qū)肫渲械牟糠峙咛ジ杉?xì)胞，常用的方法是。

（2）在使用合成培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常需要加入等天然成分；在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要保證被培養(yǎng)的細(xì)胞處于一定的氣體環(huán)境，所需要的氣體主要有 。

（3）科學(xué)家欲進(jìn)行胚胎分割移植，則應(yīng)該選擇發(fā)育良好、形態(tài)正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養(yǎng)皿中，然后用分割針進(jìn)行分割。

答案：（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞核移植顯微注射技術(shù)（法）

（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚

2．克隆人研究

【知識(shí)鏈接】克隆人的基本原理是動(dòng)物細(xì)胞核的全能性，包括胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植。其基本過(guò)程為：

細(xì)胞核移植技術(shù)中注入去核卵母細(xì)胞中的不是供體細(xì)胞核，而是整個(gè)細(xì)胞，伴隨著兩細(xì)胞融合，體現(xiàn)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有一定的流動(dòng)性。該技術(shù)形成重組細(xì)胞繼而發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體，體現(xiàn)了細(xì)胞核的全能性而非動(dòng)物細(xì)胞的全能性。

例3 下圖為克隆人的示意圖，據(jù)圖回答：

（1）圖中所涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)有、和

等。

（2）下列有關(guān)胚胎移植的敘述正確的有（）

A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子

B.只有供、受體生理環(huán)境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續(xù)發(fā)育

C.供體和受體要進(jìn)行免疫檢查，防止發(fā)生免疫排斥反應(yīng)

D.不同動(dòng)物其胚胎移植的時(shí)間不同，人的胚胎移植最好在四個(gè)細(xì)胞階段進(jìn)行

（3）圖中兩個(gè)嬰兒長(zhǎng)大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說(shuō)明 具有全能性。

（4）使用培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常要加入等天然成分，除了保證被培養(yǎng)細(xì)胞處于無(wú)菌、無(wú)毒及充足氧氣的環(huán)境中，還需要保證細(xì)胞生活所需的；早期胚胎發(fā)育在階段以前的細(xì)胞是全能細(xì)胞。

（5）圖中從“內(nèi)細(xì)胞團(tuán)到胚胎干細(xì)胞”的培養(yǎng)過(guò)程中，必須用處理內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，使之分散成單個(gè)細(xì)胞。干細(xì)胞形成組織、器官必須要進(jìn)行 和 。

（6）在體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞能否獲得動(dòng)物器官?

。為什么？

解析：（1）該圖利用了細(xì)胞核移植、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎分割移植等技術(shù)。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態(tài)，才能保證胚胎的正常發(fā)育。（3）克隆過(guò)程說(shuō)明動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性。（4）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件：無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（合成培養(yǎng)基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環(huán)境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個(gè)細(xì)胞。（6）胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下一般只能增殖進(jìn)行細(xì)胞分裂，不能發(fā)生細(xì)胞分化。

答案：（1）核移植 胚胎移植 細(xì)胞培養(yǎng)（另外寫細(xì)胞融合、胚胎分割也對(duì)，寫了三個(gè)則給滿分）（2）ABD（3）動(dòng)物體細(xì)胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細(xì)胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可以增殖而不發(fā)生分化

3．生物技術(shù)中的倫理問(wèn)題

【知識(shí)鏈接】生物技術(shù)引發(fā)的倫理問(wèn)題包括克隆技術(shù)引發(fā)的倫理問(wèn)題、試管嬰兒引發(fā)的倫理問(wèn)題、基因檢測(cè)引發(fā)的倫理問(wèn)題。中國(guó)政府對(duì)于克隆技術(shù)的態(tài)度是禁止生殖性克隆人，不反對(duì)治療性克隆人；對(duì)于試管嬰兒的態(tài)度，中國(guó)衛(wèi)生部的規(guī)定是實(shí)施體外受精、胚胎移植及衍生技術(shù)必須獲得衛(wèi)生部的批準(zhǔn)證書。

例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過(guò)程。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）圖中①為 細(xì)胞，過(guò)程A是目前實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞克隆的關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)稱為 。

（2）圖中③能誘導(dǎo)分化出神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞，其根本原因是 的結(jié)果。這樣培育得到的組織器官進(jìn)行自體移植的最大好處是 。

（3）若應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因?qū)虢Y(jié)構(gòu)④中的

，原因是這些細(xì)胞 。

（4）在用PCR技術(shù)擴(kuò)增胰島素基因時(shí)，緩沖溶液中必須加入的物質(zhì)有：、分別與兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。

（5）我國(guó)政府禁止生殖性克隆，但不反對(duì)治療性克隆研究。為什么要反對(duì)生殖性克隆（即克隆人）呢？請(qǐng)你寫出一條理由： 。

解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細(xì)胞的核與卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行重組， 形成重組細(xì)胞，將重組細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)得到囊胚，取囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)得到不同組織器官，可用于進(jìn)行自體移植，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

答案：（1）次級(jí)卵母（卵） 核移植

（2）基因選擇性表達(dá)不會(huì)產(chǎn)生排異（免疫排斥）反應(yīng)

（3）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化程度極低（或具有全能性），可使外源基因在相應(yīng)組織細(xì)胞表達(dá)

干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文第4篇

【摘要】 目的 探索大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況。方法 采用全骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)細(xì)胞，貼壁篩選純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，應(yīng)用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)誘導(dǎo)分化出肝干細(xì)胞，鑒定后，經(jīng)肝臟中葉注射入同種異體正常組和暴發(fā)性肝衰竭組大鼠體內(nèi)，于移植后的第1、2、4周取受體肝臟移植原位（注射部位)、鄰位（距注射部位0.5 cm)組織，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)性別決定因子基因片段，研究肝干細(xì)胞在大鼠肝臟內(nèi)定居情況。結(jié)果 經(jīng)肝臟注射移植的肝干細(xì)胞在正常組和肝損傷組的肝臟內(nèi)均能定居，且定居的細(xì)胞數(shù)量上肝損傷組明顯多于正常組。結(jié)論 經(jīng)肝臟注射移植的骨髓源性肝干細(xì)胞可以定居于肝臟內(nèi)，且定于肝臟的干細(xì)胞數(shù)量與肝臟是否損傷密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝干細(xì)胞；細(xì)胞移植

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 具有多向分化潛能，可以在體外誘導(dǎo)分化出肝干細(xì)胞，此種骨髓源性肝干細(xì)胞可以為肝組織移植工程提供新的細(xì)胞來(lái)源。近年來(lái)的研究主要集中于體外誘導(dǎo)MSCs為肝干細(xì)胞，此種細(xì)胞具備了肝細(xì)胞的形態(tài)，在體外能夠表現(xiàn)出一定的肝細(xì)胞功能〔1〕，但對(duì)骨髓源性肝干細(xì)胞在體內(nèi)的定居和定位能力情況尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)、分化出肝干細(xì)胞，同時(shí)建立暴發(fā)性大鼠肝衰竭模型，探討骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況。

1 材料與方法

1.1 材料

低糖DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)(CYTOALAB公司)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma公司)；純系SD大鼠、3周齡、體重100～120 g(供體大鼠)和成年純系SD雌性大鼠、體重180～220 g(受體大鼠)，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 骨髓源性肝干細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 MSCs分離、培養(yǎng)及定向肝干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

從供體SD大鼠股骨提取骨髓細(xì)胞。用比重1.073的Percoll分離液行MSCs分離，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)和擴(kuò)增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)誘導(dǎo)定向肝干細(xì)胞分化。

1.2.2 誘導(dǎo)后的骨髓源性肝干細(xì)胞鑒定

用ELASA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞中細(xì)胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表達(dá)。

1.3 肝損傷動(dòng)物模型的制作和分組

受體雌性SD大鼠20只，隨機(jī)分為正常大鼠組和肝損傷組。肝損傷組用質(zhì)量濃度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔內(nèi)注射，劑量1 200 mg/kg體重。

1.4 同種異體大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞移植

正常組大鼠和肝損傷組大鼠，分別以戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒、備皮、鋪無(wú)菌巾，上腹正中切口，長(zhǎng)約1 cm，于肝中葉以BD胰島素注射器注射肝干細(xì)胞懸液0.4 ml（107/ml )，觀察無(wú)出血后縫合傷口。

1.5 受體體內(nèi)移植骨髓源性肝干細(xì)胞鑒定

應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)性別決定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干細(xì)胞移植后1，2，4 w后取受體肝臟移植原位(注射部位)、鄰位(距注射部位0.5 cm)組織，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)〔2〕性別決定因子基因片段(Sry)。引物按文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計(jì)，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物對(duì)SRY1/ SRY2擴(kuò)增片段大小為317 bp，內(nèi)引物對(duì)SRY3/SRY4擴(kuò)增片段大小為121 bp。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓源性肝干細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 大鼠MSCs經(jīng)原代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代，誘導(dǎo)分化，細(xì)胞異形性較誘導(dǎo)前增加，表現(xiàn)為圓形、橢圓形細(xì)胞數(shù)量較誘導(dǎo)前明顯增加，而梭形細(xì)胞數(shù)量減少，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d左右，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為圓形、橢圓形細(xì)胞為主，梭形細(xì)胞已極少見(jiàn)。免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺（DAB)顯色，在倒置顯微鏡下，可見(jiàn)細(xì)胞形狀顯圓形或卵圓形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。CK18、CK19、Vimentin呈陽(yáng)性表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)液中AFP、ALB含量誘導(dǎo)前分別為(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；誘導(dǎo)后分別為(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。誘導(dǎo)后的AFP、ALB含量明顯高于誘導(dǎo)前（P＜0.05)。表明經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs分化為肝干細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

2.2 肝損傷模型病理結(jié)果

D氨基半乳糖注射后，大鼠肝臟肝索紊亂，肝細(xì)胞腫脹變性、灶性及大片壞死，伴出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

2.3 性別決定因子基因片段檢測(cè)結(jié)果

肝損傷組：檢測(cè)1 w時(shí)陰性，2 w時(shí)原位肝組織Sry陽(yáng)性表達(dá)，鄰位未表達(dá)，而4 w時(shí)原位及鄰位組織檢測(cè)到Sry表達(dá)，原位表達(dá)較2 w時(shí)增強(qiáng)，鄰位較弱。正常肝臟組：1及2 w均未檢測(cè)到表達(dá)，4 w時(shí)檢測(cè)到原位微弱表達(dá)。見(jiàn)圖3。

3 討 論

MSCs具有多向分化潛能，特別是具有向肝臟干細(xì)胞、肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能〔4〕，因而有望成為肝組織移植工程新的種子細(xì)胞來(lái)源。由于MSCs是成體干細(xì)胞，取材方便，可以來(lái)自患者自身，無(wú)排斥反應(yīng)，故具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化為肝干細(xì)胞，對(duì)骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況進(jìn)行初步研究。

目前研究表明移植肝干細(xì)胞可存活于受體許多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、腸系膜、腎及腎脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝臟由于其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境、生理及解剖結(jié)構(gòu)環(huán)境無(wú)疑是最理想的場(chǎng)所，可經(jīng)門靜脈輸入或肝實(shí)質(zhì)植入，該組實(shí)驗(yàn)采用肝臟植入方法，取得較好效果，說(shuō)明此方法是安全可行的。本實(shí)驗(yàn)采用同種異體移植，應(yīng)該考慮免疫排斥反應(yīng)，但文獻(xiàn)報(bào)道，純化的MSCs具有獨(dú)特的免疫原性，進(jìn)行同種異體移植不需要預(yù)先應(yīng)用免疫抑制劑，無(wú)免疫排斥反應(yīng)，是良好的基因治療靶細(xì)胞。

目前鑒定受體體內(nèi)被移植后的肝干細(xì)胞有許多方法，其中較為常用的是以雄性動(dòng)物為肝干細(xì)胞供體〔1〕，雌性動(dòng)物接受細(xì)胞移植后，分化增殖的細(xì)胞 Y 染色體陽(yáng)性，證明雌性受體內(nèi)存活的細(xì)胞來(lái)自雄性供體細(xì)胞，這就可以清楚地將植入的細(xì)胞與原有的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，進(jìn)一步研究移植作用，本實(shí)驗(yàn)采用雄性供體細(xì)胞為雌性受體移植，檢測(cè)移植部位細(xì)胞的Y染色體表達(dá)情況，進(jìn)而檢測(cè)移植細(xì)胞是否定植。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位檢測(cè)到表達(dá)，4 w表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且臨近部位出現(xiàn)表達(dá)；正常大鼠在移植后4 w移植原位出現(xiàn)微弱表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨髓源性肝干細(xì)胞在正常大鼠肝臟及肝損傷大鼠肝臟內(nèi)均能定居，但在肝損傷大鼠肝臟內(nèi)定居能力明顯增強(qiáng)?？紤]可能為大鼠肝損傷后，刺激機(jī)體分泌出各種促進(jìn)肝細(xì)胞再生的生長(zhǎng)因子，為移植細(xì)胞提供定居所需的微環(huán)境。文獻(xiàn)報(bào)道，在正常大鼠體內(nèi)，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝損傷時(shí)，啟動(dòng)肝再生程序，這些因子才能被激活，引起肝細(xì)胞有絲分裂。

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞移植后可以定居于受體肝臟內(nèi)，而且在肝損傷后有利于干細(xì)胞移植的定居，這為下一步研究定居于肝內(nèi)的骨髓源性肝干細(xì)胞的功能奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1 李秉璐，曲 強(qiáng)，趙玉沛，等.人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過(guò)程中白蛋白的表達(dá)研究〔J〕.中華外科雜志，2005；43（11)：7135.

2 高英堂，馬夢(mèng)蘭，劉 敏.人類Sry基因用于產(chǎn)前診斷的初步研究〔J〕.中華婦產(chǎn)科雜志，1997；32（11)：6524.

3 Tashiro H，F(xiàn)ukuda Y，Kimura A，et al.Assessment of microchimerism in rat liver transplantation by polymerase chain reaction〔J〕.Hepatology，1996；23（4):82834.

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5 張剛慶，方馳華，池達(dá)智.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華外科雜志，2005；43（11)：71620.

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干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文第5篇

[關(guān)鍵詞]表皮干細(xì)胞；酶消化法；組織工程皮膚；分離；培養(yǎng)

[中圖分類號(hào)]R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2011）01-0079-04

Improved culture method of Human epidermal stem cell and tissue engineering skin construction

ZHANG Yan-gang, HU Da-hai, ZHANG Zhan-feng,CAI Wei-xia, ZHU Hua-yu, SHE Tao

(Department of Burn and Skin Surgery, Burns Center of PLA, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 701132,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo improve the traditional methods of dissociation and culture of the human epidermal stem cells (hESCs) and provide more productive and more active seed cells for tissue engineering skin construction.MethodsCell morphology was observed by inverted microscope, MTT law growth curve. Immunocytochemistry was used to observe the expression of β1 integrin and keratin 19 (CK19) on epidermal stem cells. Compare the morphological features of tissue engineered skin constructed with the seed cells which were obtained by two methods.Results Trypan blue staining displays the number of hESCs dissociated by modified method is(92.25±15.61)significantly elevated compared with traditional method (68.50±26.91)(P＜0.01),and the proportion of living cells 94%±0.01% increased significantly compared with traditional method(75%±0.04%)(P＜0.05).The result of immunocytochemistry showed that the expression of β1 integrin and keratin 19(CK19) was positive, which were markers of hESCs. HE staining showed that, by using the improved method, the number of multiple epidermal layers was 5～6 on tissue engineering, and cells of epidermal in the basal partwere arranged. In contrast, the number of multiple epidermal layers was 3～4, and the cells of epidermal in basal part arranged in scattered by using the traditional method. ConclusionHuman epidermal stem cells in a larger amount and better vitality can be obtained by using a modified enzyme digestion method, which form basis of construction of skin tissue engineering.

Key words:human epidermal stem cells; enzyme digestion; tissue engineering skin; dissociating; culturing

近年來(lái)仿照皮膚的生理結(jié)構(gòu)，人們構(gòu)建各種組織工程皮膚，有望解決皮源短缺及預(yù)后瘢痕的問(wèn)題，其種子細(xì)胞主要是表皮干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。因此，表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)就成了必須面對(duì)的問(wèn)題，在以往的報(bào)道中[1-4]，有關(guān)hESCs的培養(yǎng)常采用中性蛋白酶（Dispase）消化過(guò)夜分離表皮層、再以0.25%胰蛋白酶37℃消化10～15 min分離表皮干細(xì)胞，但實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)該方法存在細(xì)胞活力差，產(chǎn)率低等缺點(diǎn)。本研究中我們采用改良后的方法分離培養(yǎng)hESCs并和常規(guī)的培養(yǎng)方法加以比較，旨在建立一種更為高效的分離培養(yǎng)表皮干細(xì)胞的方法。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器：取小兒包皮組織（2～6歲），(來(lái)自西京醫(yī)院泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)，均取得患者家屬知情同意)。DispaseⅡ酶（Gibco）；Trypsin（Gibco）；DMEM (Hyclone)；胎牛血清（FBS，杭州四季青）；角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(K-SFM，Gibco)；表皮生長(zhǎng)因子（epidemal growth factor, EGF）和牛垂體提取物（bovine pituitary extract, BPE）(Gibco)；人胎盤Ⅳ型膠原(Sigma)，MTT (Gibco)；DMSO (西安化學(xué)試劑廠)；多聚甲醛(西安化學(xué)試劑廠)；小鼠抗人β1整合素（鼠單抗IgG）、CK19（鼠單抗IgG） (北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；鼠尾膠原（自制）；臺(tái)盼藍(lán)；倒置熒光顯微鏡（Olympus）；M680型酶標(biāo)儀（伯樂(lè)公司）。

1.2人表皮干細(xì)胞分離、培養(yǎng)：修剪皮下結(jié)締組織，0.9% NaCl浸泡、清洗3遍，每次5～10min，0.05%醋酸氯已定+0.9% NaCl（1:2，體積比）浸泡5～8min，再次0.9% NaCl浸泡清洗3遍，每次10min，然后將上述組織塊置于4℃ Dispase酶(0.25%)浸泡14～16h。以下為兩種方法分離人表皮干細(xì)胞。

傳統(tǒng)方法：取出皮片，0.9% NaCl反復(fù)清洗，分離表皮和真皮層，剪碎表皮為1.0mm×1.0mm，加0.25% Trypsin + 0.02% EDTA，37 ℃水浴10min加入含有10% FBS的DEME終止消化。反復(fù)吹吸至細(xì)胞懸浮，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000rpm離心5～10min，棄上清，收集細(xì)胞，用人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞（10ml），吹打成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色。并接種于預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原的25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育10～15 min后，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，PBS洗2次，加入適量新鮮培養(yǎng)基（K-SFM，5ng/ml hEGF，30 μg/ml BPE）繼續(xù)培養(yǎng)。

改良方法：取出皮片，0.9%氯化鈉反復(fù)清洗，分離表皮和真皮層，將表皮置于小抗生素瓶后加0.125% Trypsin+ 0.01% EDTA3ml，彎頭吸管快速攪拌2min，吸出并加入離心管（已經(jīng)加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，再次重復(fù)消化一次，吸出后加入另一離心管（已經(jīng)加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，將前后兩次消化液體合并，離心（1 000rpm，5min），PBS10ml懸浮細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定后，再次離心（1000rpm，5min），表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基（K-SFM）懸浮細(xì)胞，接種于預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育4～5min后，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，PBS洗2次,加入適量新鮮表皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)（K-SFM，5ng/ml hEGF, 30μg/ml BPE）。

1.3表皮干細(xì)胞增殖：將兩種方法分離出的hESCs分別作MTT比色試驗(yàn)。兩組細(xì)胞均以1×105個(gè)/孔的密度接種預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原的24孔板內(nèi)，每24h取3孔做MTT比色實(shí)驗(yàn)。根據(jù)每天記錄的細(xì)胞數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.4 表皮干細(xì)胞鑒定：取二代表皮干細(xì)胞培養(yǎng)36 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗；0.1%Triton X-100孵育10min；PBS清洗3次，每次5min；3%H2O2去離子水孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；2%山羊血清封閉20 min,加入CK19（1:50稀釋）、整合素-β1（1:50稀釋）一抗4 ℃過(guò)夜；PBS洗5次，滴加生物素化二抗工作液200μl，37℃孵育10min，PBS洗5次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液200μl, 37℃孵育10min，PBS洗5次；顯色劑顯色。

1.5構(gòu)建組織工程皮膚：以兩種不同方法分離、培養(yǎng)的hESCs為種子細(xì)胞，鼠尾膠原復(fù)合成纖維細(xì)胞作為支架材料構(gòu)建組織工程皮膚。4ml 5×DMEM和14ml膠原于冰上混勻，用1mol/L NaOH調(diào)至中性后，加入2mlFBS（含2×106成纖維細(xì)胞）混勻，以3ml/孔加入Transwell小室內(nèi)，放入37℃，5% CO2孵箱培育，待其凝固后加入10% FBS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)，24h后將2代hESCs以3×106/孔種植于鼠尾膠原表面，氣-液面培養(yǎng)1周。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間均數(shù)比較行兩樣本t的方差分析， P＜0.05為差異有顯著性意義。

2結(jié)果

2.1 改良消化法和傳統(tǒng)消化法細(xì)胞消化效率的比較：將同一塊包皮組織等份分開(kāi)，用兩種方法同時(shí)分離表皮細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)（總體積均為10ml），實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)5次。

2.2改良法和傳統(tǒng)法分離細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較：采用Ⅳ型膠原粘附法分選表皮干細(xì)胞，改良法較傳統(tǒng)法粘附細(xì)胞密度大，4h后大部分細(xì)胞貼壁良好，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞體小，核質(zhì)比大，呈三角形或多邊形。接種后第二天培養(yǎng)基中存在一定數(shù)量的漂浮細(xì)胞，但改良法漂浮細(xì)胞數(shù)明顯少（圖2）。3天后，有部分細(xì)胞形成較小克隆，胞體緊密相靠，胞膜互相銜接，呈典型“鋪路石樣”生長(zhǎng)。

2.3改良法和傳統(tǒng)法細(xì)胞增殖比較：兩組細(xì)胞在第2天細(xì)胞數(shù)量有所下降，均在第4天時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，改良法細(xì)胞在對(duì)數(shù)期呈明顯上升趨勢(shì)，于第7天到達(dá)平臺(tái)期，鏡下觀察細(xì)胞融合；傳統(tǒng)法細(xì)胞對(duì)數(shù)期上升緩慢，第8天時(shí)細(xì)胞仍未融合。由此表明出改良法細(xì)胞活性較好生長(zhǎng)較快（圖3）。

2.4改良法和傳統(tǒng)法分離細(xì)胞的鑒定天對(duì)采用兩種方法培養(yǎng)的hESCs行K19、β1整合素免疫染色，結(jié)果顯示，95%以上細(xì)胞K19、β1整合素均呈陽(yáng)性表達(dá)(圖4)，且兩種方獲得的表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性無(wú)顯著差異。

2.5 改良法和傳統(tǒng)法分離的細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚組織學(xué)比較：兩種方法分離培養(yǎng)的hESCs分別構(gòu)建出的組織工程皮膚均呈3層：由下到上為真皮層、表皮層、角質(zhì)層。改良法細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚表皮層厚，約5～6層，表皮和真皮交接處可見(jiàn)細(xì)胞排列整齊，形似基底細(xì)胞。傳統(tǒng)法細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚表皮層較薄，約3～4層，表皮真皮交接處未見(jiàn)類似基底細(xì)胞（圖5）。

3 討論

hESCs是皮膚組織的特異性干細(xì)胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能。是皮膚發(fā)生、修復(fù)、重塑的關(guān)鍵性源泉[5]，以其作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚，可獲得與生理皮膚相類似的組織結(jié)構(gòu)。臨床上大面積較深度燒傷往往導(dǎo)致表皮、真皮的損傷缺失，近年來(lái)，利用含有hESCs的組織工程皮膚覆蓋創(chuàng)面取得一定的效果，而在其構(gòu)建的過(guò)程中表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)是必須面對(duì)的問(wèn)題。

傳統(tǒng)的方法中表皮層與真皮層分離后，用剪刀剪碎成1.0mm×1.0mm大小后進(jìn)行胰蛋白酶消化，減碎的過(guò)程中暴露在組織邊緣的細(xì)胞增多，而剪刀的擠壓可對(duì)組織造成擠壓損傷[6]，導(dǎo)致部分細(xì)胞壁損害進(jìn)而細(xì)胞活力下降或死亡，在改良的方法中，直接進(jìn)行胰酶消化避免了這一損傷情況的發(fā)生。在胰酶消化這一步，傳統(tǒng)方法采用0.25%胰蛋白酶＋0.02% EDTA，37℃水浴，10min，而改良方法以0.125%＋0.01% EDTA胰蛋白酶也可以消化下來(lái)表皮干細(xì)胞，并且胰蛋白酶的含量低，減少了胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)胰酶將細(xì)胞分泌的粘蛋白膜水解后，如還沒(méi)有終止它的活性，此時(shí)胰酶就有可能進(jìn)攻細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白質(zhì)，造成它們的解離，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[7]。胰酶濃度的降低也少了中和血清的用量，從而降低了血清對(duì)hESCs分化的影響[8]。對(duì)比傳統(tǒng)方法，將37℃消化改為常溫下消化，進(jìn)一步降低胰酶的活性。為了進(jìn)一步減少胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷，再將傳統(tǒng)方法的消化10min改良為2次消化，每次2min總計(jì)4min，每次消化后立即終止。以往的方法中，用來(lái)消化時(shí)，將剪碎的細(xì)胞置于胰酶中反復(fù)吹打，而吹打本身也會(huì)造成細(xì)胞損傷，且吹打容易產(chǎn)生泡沫加劇細(xì)胞損害，本改良方法中，只以吸管做攪動(dòng)，充分均勻胰酶的消化作用又不會(huì)產(chǎn)生吹吸的作用，減少了細(xì)胞在反復(fù)吹打過(guò)程中的損傷。

將同一塊包皮組織等份分開(kāi)，用兩種方法同時(shí)分離hESCs，臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明：改良法的活細(xì)胞率明顯大于傳統(tǒng)法細(xì)胞，從形態(tài)上觀察，細(xì)胞展開(kāi)生長(zhǎng)無(wú)差異。我們用兩種方法培養(yǎng)的原代細(xì)胞繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖3），可以看出改良法細(xì)胞存活數(shù)量多，增殖速度快，細(xì)胞活性好，證明了改良法培養(yǎng)可以快速獲得大量hESCs。研究表明，K19表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞多分布在毛囊隆突部和基底膜，且具有干細(xì)胞的慢周期性和強(qiáng)大的增殖特性，而終末分化的表皮細(xì)胞則表達(dá)K10。所以K19也被認(rèn)為是表皮干細(xì)胞的特異性標(biāo)志[9]。β1整合素不僅介導(dǎo)表皮干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，也調(diào)控終末分化啟動(dòng)，β1整合素表達(dá)的降低會(huì)刺激表皮干細(xì)胞離開(kāi)干細(xì)胞池，向上遷移成為終末分化細(xì)胞，因而認(rèn)為β1整合素高表達(dá)可以是表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物之一[10-11]。我們將應(yīng)用Ⅳ膠原快速貼壁的改良法細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)方法研究，顯示改良法細(xì)胞K19、β1整合素呈陽(yáng)性表達(dá)，證實(shí)了采用改良方法培養(yǎng)的細(xì)胞為hESCs。進(jìn)一步分別采用兩組細(xì)胞為種子細(xì)胞，鼠尾膠原為支架構(gòu)建組織工程皮膚，組織切片HE染色顯示改良組hESCs細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚表皮層較厚，細(xì)胞復(fù)層多，表皮細(xì)胞復(fù)層層數(shù)為5～6層、基底細(xì)胞排列整齊，而傳統(tǒng)組hESCs構(gòu)建的組織工程皮膚表皮細(xì)胞復(fù)層層數(shù)為3-4層、基底細(xì)胞排列散亂，表明應(yīng)用改良組細(xì)胞更適宜構(gòu)建組織工程皮膚（圖5）。

表皮干細(xì)胞是一種在成年期還能維持較高的自我更新能力的細(xì)胞群，在正常狀態(tài)下維持表皮的自我更新，當(dāng)受到損傷刺激時(shí)，表皮干細(xì)胞可以參與皮膚損傷的修復(fù)[12]，本研究采用改良法分離培hESCs并與傳統(tǒng)方法對(duì)比，顯示出改良方法培養(yǎng)出的hESCs活力和增值能力更好，構(gòu)建的組織工程皮膚具有更好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，為以表皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。

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