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本文作者：宋霖蔡春芳葉元土王永玲劉猛孔麗作者單位：蘇州大學(xué)

材料與方法

1試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)所用魚粉(FM)購自通威股份有限公司，為俄羅斯進(jìn)口魚粉(粗蛋白64.5%、粗灰分14%、粗脂肪5.6%、組胺334mg/kg);魚油購自浙江金大地飼料有限公司，豆粕(粗蛋白43.5%、粗纖維5.1%)、花生粕(粗蛋白44.7%、粗纖維5.9%)、菜籽粕(粗蛋白38.6%、粗纖維18%)和棉籽粕(粗蛋白47%、粗纖維10.2%)購自東海糧油工業(yè)張家港有限公司。對(duì)照組魚粉含量為60%。試驗(yàn)飼料中豆粕、花生粕、棉粕和菜粕的添加水平分別為25%和50%(表1)。本試驗(yàn)未采用傳統(tǒng)營養(yǎng)學(xué)研究使用的等氮等能配方，一是因?yàn)轱暳显现械目範(fàn)I養(yǎng)因子［9-11］會(huì)影響到腸道形態(tài)，設(shè)計(jì)等氮等能飼料必然要加入其它原料，可能會(huì)干擾結(jié)果的可靠性。二是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃u(píng)價(jià)原料安全性，不需要飼料等氮等能。三是大量關(guān)于腸道健康研究的文獻(xiàn)也都采用了非等氮等能的飼料［12-14］。各飼料原料粉碎至全部通過60目篩，按配方比例混合均勻后制成直徑2mm的硬顆粒飼料，通風(fēng)場所內(nèi)自然風(fēng)干，于－20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。飼料配方組成及營養(yǎng)水平見表1。

2試驗(yàn)魚及分組

試驗(yàn)用黃顙魚購于蘇州市水產(chǎn)養(yǎng)殖總場澄湖場，為當(dāng)年池塘養(yǎng)殖魚種。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后用對(duì)照組飼料馴養(yǎng)，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后(1周)，選取大小均勻、體格健壯，體質(zhì)量為(295±0.35)g的魚種，稱重后隨機(jī)分配到45個(gè)玻璃鋼水族箱中(110cm×70cm×65cm)，每缸15尾。各試驗(yàn)組按完全隨機(jī)化配置法分布以避免位置的差異造成的試驗(yàn)誤差。

3飼養(yǎng)管理

所有水族箱在同一半開放式可控溫循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，以充分曝氣的自來水為水源，每天換水為總水量的1/3。養(yǎng)殖水經(jīng)過濾、沉淀后流回蓄水池，經(jīng)過增氧、控溫后由水泵抽回各水族箱。飼養(yǎng)期從2010年4月7日至2010年6月2日，為期8周。養(yǎng)殖期間光周期12h∶12h，水面照度(2500±300)Lx，水溫(25±2)℃，DO＞5.0mg/L，pH7.5±0.2，NH4+-N(0.25±0.05)mg/L，NO2－N(0.04±0.01)mg/L，硫化物＜0.05mg/L。每種飼料投喂5缸黃顙魚，每日投飼3次(8∶00，13∶00，18∶00)，飽食投喂。

4采樣與分析方法

采樣均在攝食后半小時(shí)進(jìn)行，迅速將魚撈起，使用MS-222麻醉，統(tǒng)計(jì)各組試驗(yàn)魚的尾數(shù)，計(jì)算成活率;稱量每缸魚的總體質(zhì)量，計(jì)算蛋白質(zhì)效率。測定體長，解剖取腸道并測定腸長，計(jì)算腸長指數(shù)。成活率(SR)=(Nt/N0)×100%蛋白質(zhì)效率(PER)=(Wt－W0)/CP×100%腸長指數(shù)=GL/BL上式中，Nt表示試驗(yàn)?zāi)~尾數(shù)，N0表示試驗(yàn)初魚尾數(shù)，Wt表示試驗(yàn)?zāi)┟扛佐~體總重，W0表示試驗(yàn)初每缸魚體總重，CP表示每缸飼料蛋白攝入量，GL表示腸長，BL表示體長。每個(gè)處理隨機(jī)取10尾魚，分離出腸道，剔除表面脂肪組織，在腸道第一個(gè)回折后1cm處剪取中腸1cm左右大小的組織塊(圖1)，迅速固定于Bouin’s液中。試驗(yàn)取中腸是因?yàn)閷?duì)黃顙魚的前期研究發(fā)現(xiàn)，黃顙魚中腸對(duì)于飼料組分比較敏感。按常規(guī)組織切片制備程序，進(jìn)行水流沖洗、梯度乙醇脫水，二甲苯中透明以及石蠟包埋。然后使用YD-202型切片機(jī)橫向切片，厚度為5μm，展片后采用H-E染色，中性樹膠封片。使用OLYMPUSDP72光學(xué)顯微鏡觀察并拍片，腸道形態(tài)的評(píng)價(jià)參ST:胃;FG:前腸;MG:中腸;HG:后腸;SL:取樣部位數(shù)包括:消化管橫切面上的黏膜皺褶個(gè)數(shù);腸道黏膜褶皺的高度與寬度;褶皺中固有層的寬度;黏膜下層厚度;嗜堿粒細(xì)胞向固有層和黏膜下層的滲透程度;核上空泡的存在與多少;肌層厚度。

5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后用Turkey’s多重比較，以分析組間的差異顯著性程度，顯著水平為0.05。

結(jié)果與分析

1黃顙魚生長及四種植物蛋白對(duì)其影響

整個(gè)試驗(yàn)過程中無異常情況發(fā)生，黃顙魚增重一倍左右，各組成活率均為100%。對(duì)照組的蛋白質(zhì)效率高于所有實(shí)驗(yàn)組，除豆粕組外其余試驗(yàn)組蛋白質(zhì)效率隨著飼料中植物蛋白水平提高而下降。豆粕組和棉粕組與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)，50%花生粕組和50%菜籽粕組的蛋白質(zhì)效率均顯著小于對(duì)照組(P＜0.05)。

2黃顙魚腸道形態(tài)及四種植物蛋白對(duì)其影響

飼喂不同含量的四種植物蛋白8周黃顙魚中腸組織形態(tài)發(fā)生了一定程度的改變(表3)。各試驗(yàn)組腸長指數(shù)相較對(duì)照組均有所增大，但無顯著性差異(P＞0.05)。觀察黃顙魚中腸的組織切片發(fā)現(xiàn):腸道組織結(jié)構(gòu)可分為黏膜層(mucosa)、黏膜下層(submucosa)、肌層(muscularis)和漿膜層(serosa)，攝食魚粉飼料的對(duì)照組黃顙魚中腸黏膜層向腸腔內(nèi)折疊形成豐富的黏膜褶，黏膜褶形狀完整，有的筆直伸入腸腔內(nèi)，有的彎曲伸展，有分支，排列密集。腸黏膜由單層柱狀上皮細(xì)胞組成，上皮細(xì)胞排列緊密而整齊，核圓形位于細(xì)胞中部。黏膜褶高度及寬度均大于各植物蛋白組，肌層厚而致密(圖版Ⅰ－1，2)。25%豆粕組黏膜褶數(shù)目較對(duì)照組有所減小，是試驗(yàn)組中密度最大的(表3)。黏膜褶略有缺刻，頂端與食糜接觸的部分有損傷，黏膜褶中單層柱狀細(xì)胞破損，細(xì)胞核擠在一起。固有層中略有淋巴細(xì)胞浸潤，空泡數(shù)目略有增多(圖版Ⅰ－3)。50%豆粕組黃顙魚黏膜褶之間排列變稀疏，根部的黏膜上皮細(xì)胞即被破壞，有的黏膜褶整個(gè)受損，上皮細(xì)胞核上移且排列紊亂，邊緣缺刻較多(圖版Ⅰ－4)。黏膜褶高度顯著小于對(duì)照組，腸壁厚度亦顯著變薄且肌層稀疏(P＜0.05;表3)。25%花生粕組黏膜褶較密集，黏膜褶高度較對(duì)照組降低了24.4%(表3)。黏膜褶頂部有破損且明顯變細(xì)，腸黏膜上皮細(xì)胞之間界限不清晰，空泡較多，且大小不一。黏膜下層有所增厚，但未見淋巴細(xì)胞侵入(圖版Ⅰ－5，6)。添加水平為50%的花生粕組黏膜褶數(shù)目及寬度進(jìn)一步減少。黏膜高度顯著低于對(duì)照組(P＜0.05;表3)。黏膜褶呈倒伏狀，邊緣缺刻嚴(yán)重，空泡變大，有的黏膜褶的上皮細(xì)胞均被破壞，核排列紊亂。固有層仍較寬(圖版Ⅰ－7)。25%菜粕組黏膜褶外側(cè)遍布空泡，有的黏膜褶中上皮細(xì)胞核明顯上移，淋巴細(xì)胞侵入黏膜褶中，大片上皮細(xì)胞破損(圖版Ⅰ－8，9)。上述結(jié)構(gòu)在50%菜粕組中同樣出現(xiàn)(圖版Ⅰ－10)，且各項(xiàng)腸道生長指標(biāo)較25%水平進(jìn)一步減小。棉粕組黃顙魚的黏膜高度與肌層厚度均與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05;表3)。25%水平時(shí)，淋巴細(xì)胞侵入固有層和黏膜下層中，數(shù)量上較其余試驗(yàn)組顯著增多，空泡密集且大小不一(圖版Ⅰ－11)。50%水平時(shí)，黏膜褶最少，但沒有大量淋巴細(xì)胞浸潤情況，空泡較大，上皮細(xì)胞邊界不清(圖版Ⅰ－12)。

討論

本試驗(yàn)日糧中分別添加了豆粕、菜粕、花生粕和棉粕，由于與魚粉相比在蛋白質(zhì)含量、能量含量、氨基酸組成、消化吸收率、抗?fàn)I養(yǎng)因子等方面均處于劣勢［15］，引起生長不良是在預(yù)期之內(nèi)的。豆粕是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源，然而其中含有植酸、皂苷和血細(xì)胞凝集素等抗?fàn)I養(yǎng)因子［11，16］。Krogdahl等［17］指出多數(shù)植物凝集素可以和小腸壁上皮細(xì)胞表面特異受體(多糖)結(jié)合，使絨毛產(chǎn)生病變和異常，干擾消化吸收過程。Iwashita等［18］報(bào)道大豆皂苷能與植物凝集素結(jié)合而引起虹鱒后腸非正常的組織學(xué)反應(yīng)。大西洋鮭魚在豆粕添加量10%以上就產(chǎn)生嚴(yán)重的腸炎反應(yīng)［19］，但另一方面Ostaszewska等［20］發(fā)現(xiàn)在細(xì)鱗鯧日糧中添加44%的豆粕，其前腸組織形態(tài)與對(duì)照組相似，Catacutan等［21］也報(bào)道銀紋笛鯛在豆粕添加量達(dá)到48%時(shí)腸道結(jié)構(gòu)沒有表現(xiàn)任何不正常。從本試驗(yàn)結(jié)果看，黃顙魚對(duì)豆粕的耐受性比大西洋鮭魚高。Uran等［22］觀察到豆粕誘導(dǎo)的腸炎在鯉魚飼養(yǎng)4～5周時(shí)開始修復(fù)，本試驗(yàn)中腸道樣品采集于飼養(yǎng)8周，結(jié)果仍觀察到病變癥狀，提示黃顙魚腸道對(duì)豆粕的適應(yīng)能力低于鯉魚。目前對(duì)于日糧中添加花生粕而影響動(dòng)物健康的原因一般認(rèn)為是花生粕容易感染黃曲霉，黃曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素(Aflatoxin)會(huì)抑制水產(chǎn)動(dòng)物生長并對(duì)其生理機(jī)能造成一定的影響［23］。魚類中毒癥狀表現(xiàn)為生長緩慢、肝臟和其它器官受損、死亡率增加［24］。從本試驗(yàn)結(jié)果看，黃顙魚花生粕適宜添加量在25%以下。本試驗(yàn)中菜粕添加量為25%時(shí)即引起中腸嚴(yán)重的病理反應(yīng)，添加量達(dá)到50%時(shí)對(duì)于腸道生長更加不利。菜籽中含有硫葡萄糖苷，其水解產(chǎn)物有異硫氰酸酯、硫氰酸酯等。異硫氰酸酯有辛辣味，長期或大量飼喂會(huì)引起腸炎［25-26］。因此菜粕的添加量不宜超過25%。棉粕中游離棉酚的毒性限制了其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用，游離棉酚的活性醛基和羥基與蛋白質(zhì)結(jié)合，會(huì)抑制魚的生長［27-28］、降低血紅蛋白數(shù)［29］。而異育銀鯽中棉粕的添加量在20%，40%，56%時(shí)對(duì)生理和腸道健康均未造成顯著性影響［30］。對(duì)虹鱒三年的養(yǎng)殖試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)日糧可以完全以棉粕替代而對(duì)其生長不會(huì)造成損害［31］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)25%棉粕組腸道黏膜下層有淋巴細(xì)胞浸潤，50%棉粕組淋巴細(xì)胞浸潤沒有增強(qiáng)，且棉粕組蛋白質(zhì)效率與對(duì)照組沒有顯著差異，說明黃顙魚對(duì)棉粕有一定的適應(yīng)性及耐受力。總體來看，飼料中添加高劑量的植物蛋白黃顙魚腸道形態(tài)都表現(xiàn)出了一定的變化。魚類腸道形態(tài)因飼料組分不同而改變這種現(xiàn)象在大西洋鮭［19］、鯉魚［22］、歐洲真鱸［32］都有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)中黃顙魚腸道形態(tài)的變化特征與上述報(bào)道基本一致。但魚類對(duì)植物蛋白中致敏因子的炎癥反應(yīng)因魚而異。Refstie等［33］研究大西洋鱈魚時(shí)，不添加豆粕和添加25%的試驗(yàn)組在腸道區(qū)域形態(tài)學(xué)上沒有發(fā)現(xiàn)明顯不同。斑點(diǎn)叉尾鮰［34］和埃及鰨［35］也沒有因?yàn)閿z食含豆粕的飼料而出現(xiàn)腸道形態(tài)學(xué)變化。顯然，黃顙魚屬于對(duì)這些植物蛋白中的致敏因子比較敏感的種類。因此，在飼料原料選用時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。本試驗(yàn)觀察到腸道肌層厚度組間差異顯著。這在文獻(xiàn)資料中很少報(bào)道。我們推測，植物蛋白中所含的大量不消化成分，例如非淀粉多糖等，導(dǎo)致腸道充盈度提高，腸腔擴(kuò)張，從而可見肌層變薄。由此我們認(rèn)為今后進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)不僅應(yīng)在攝食后相同時(shí)刻采樣，且不需將腸道剖開，這樣就能判斷肌層厚度和絨毛高度與腸道充盈度是否相關(guān)。根據(jù)本試驗(yàn)研究，在黃顙魚飼料植物蛋白選用時(shí)，豆粕和棉粕要優(yōu)于花生粕和菜粕，花生粕、棉粕、菜粕適宜添加量在25%以下，豆粕在50%以下，但具體安全添加水平還有待研究。