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本文作者：劉萍1鄭慧玲2趙竟男3吳建偉4蘇曉慶1

作者單位：1.貴陽醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室2.貴陽市婦幼保健醫(yī)院優(yōu)生遺傳科3.艾迪康臨床檢驗所有限公司4.貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室

貴陽腐霉Pythiumguiyangense是貴陽醫(yī)學(xué)院于1994年分離得到的一株滅蚊真菌[1]。經(jīng)課題組實驗研究證實它具有滅蚊能力強、繁殖速度快、易于人工培養(yǎng)[2]、可移植性強以及對非靶生物相對安全等諸多優(yōu)點[34]。然而,和其它昆蟲病原真菌一樣,貴陽腐霉也具有毒力不穩(wěn)定、擊倒害蟲所需時間較長、對環(huán)境依賴性強以及長期人工傳代菌株退化等缺點,要將其開發(fā)成生物防治劑,真正用于蚊蟲生物防治,目前還有許多工作要做。在基因工程技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物遺傳改造的今天,采用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)培育新菌株是可行的。

昆蟲病原真菌入侵靶標(biāo)昆蟲過程中分泌一系列蛋白質(zhì)酶、幾丁質(zhì)酶和脂酶等體壁降解酶降解昆蟲體壁,與菌絲產(chǎn)生的機械壓力協(xié)同作用,穿透昆蟲體壁并在蟲體內(nèi)寄生,耗竭昆蟲營養(yǎng),甚至產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物,從而導(dǎo)致靶標(biāo)昆蟲的死亡。在此過程中,類枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin-likeprotease,Pr1)是降解昆蟲體壁的重要參與者[5]。St.Leger將構(gòu)巢曲霉組成性啟動子控制下的多拷貝金龜子綠僵菌Pr1基因轉(zhuǎn)入綠僵菌基因組,在煙草天蛾血淋巴中實現(xiàn)高效表達(dá),增強了綠僵菌的毒力,使殺蟲時間縮短了25%,并使蟲體取食能力大大降低[6]。該結(jié)果表明,Pr1蛋白酶基因在綠僵菌中的超表達(dá)可以明顯提高該菌的毒力。本課題組前期克隆得到1519bp的貴陽腐霉Pr1蛋白酶基因序列,其中包含一個969bp的完整的開放閱讀框[7]。在此基礎(chǔ)上,我們希望利用基因工程技術(shù)將貴陽腐霉的Pr1蛋白酶基因轉(zhuǎn)入貴陽腐霉中超量表達(dá),以期獲得高毒力的工程菌。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒:貴陽腐霉來源于貴陽醫(yī)學(xué)院蚊蟲生物防治實驗室;根癌農(nóng)桿菌LBA4404和質(zhì)粒pUC18由貴州大學(xué)趙德剛教授惠贈;pSK-hph由西南大學(xué)生物技術(shù)研究中心張永軍教授惠贈;pAN7-1由黃雋老師惠贈;pCambia-Pnos-PNN-hph由本實驗室構(gòu)建[8];引物合成與測序由上海英駿(Invitrogen)公司完成。

1.1.2蚊蟲:實驗所用蚊幼蟲為本實驗室馴化后傳代飼養(yǎng)的致倦庫蚊Culexquinquefasciatus貴陽株。

1.1.3常用培養(yǎng)基:KPYG2培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨1.50,酵母浸出粉1.50,葡萄糖3.00,膽固醇0.025,氯化鈣0.11,玉米油1.00?；钧}培養(yǎng)基(g/L):MgSO4•7H2O0.3,KH2PO40.3,NaCl0.3,葡萄糖5.0。誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L):MgSO4•7H2O0.3,KH2PO40.3,NaCl0.3,幾丁質(zhì)2.0,蟬蛻2.0,pH6.0。YEP培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,酵母提取物10.0,氯化鈉5.0,pH7.2。IM培養(yǎng)基(g/L):KH2PO41.45,K2HPO42.05,NaCl0.15,MgSO4•7H2O0.50,(NH4)2SO40.50,CaCl20.07,FeSO4•7H2O0.003,C6H12O6•H2O1.80,甘油5mL,蒸餾水定容至940mL,1×105Pa高壓滅菌20min,冷卻后加入濾過除菌的40mL1mol/LMES和20mL10mmol/L乙酰丁香酮(AS)。

1.1.4主要試劑:Taq酶、dNTP、T4DNA連接酶、各限制性內(nèi)切酶、CIAP、DNAmarker等購自TaKaRa公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、潮霉素B等抗生素購自Solarbio公司。底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA、左旋多巴(L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA)等購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1貴陽腐霉Pr1基因的克隆:根據(jù)貴陽腐霉Pr1蛋白酶基因序列(序列分析無內(nèi)含子)自行設(shè)計引物pr1-F:5-CGCGGATCCGACCCATTCCGAAAGTCCAAG-3,5端引入BamHⅠ酶切位點;pr1-R:5-GGAAGATCTTACAACCGTCCTCCTAACAC-3,5端引入BglⅡ酶切位點。尿素法提取貴陽腐霉基因組DNA[9],以其為模板,擴增Pr1基因片段。PCR反應(yīng)條件:94°C5min;94°C45s,59°C1min,72°C1min,共30個循環(huán);72°C10min。

1.2.2組成性表達(dá)載體pCambia-hph-Pr1的構(gòu)建:用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切質(zhì)粒pSK-hph,回收TtrpC片段(770bp),與用相同酶切的質(zhì)粒pUC18連接轉(zhuǎn)化,重組載體命名為pUC18-TtrpC。以貴陽腐霉基因組DNA為模板擴增Pr1片段,切膠回收,以限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BglⅡ雙酶切,得到Pr1片段(1100bp),與相同酶切的載體pUC18-TtrpC連接轉(zhuǎn)化,重組載體命名為pUC18-TtrpC-Pr1。以質(zhì)粒pAN7-1為模板,擴增Pgpd段(約2.1kb),回收該片段,用KpnⅠ和BamHⅠ酶切,與相同酶切的載體pUC18-TtrpC-Pr1連接,命名為pUC18-PgpdA-pr1-TtrpC。用HindⅢ單酶切pUC18-PgpdA-Pr1-TtrpC,回收約4.0kb片段,與相同酶切的pCambia-Pnos-PNN-hph連接轉(zhuǎn)化。獲得組成性表達(dá)Pr1的載體pCambia-hph-Pr1,凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensLBA4404中[10],70°C保存。

1.2.3根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pr1基因在貴陽腐霉的遺傳轉(zhuǎn)化:按龍朝欽等[11]方法稍改動。取含質(zhì)粒pCambia-hph-Pr1的LBA4404過夜培養(yǎng)物,用含200μmo1/LAS的YEP液體培養(yǎng)基28°C振蕩培養(yǎng)6h后,與貴陽腐霉菌絲混合,26°C培養(yǎng)24h。棄上清,加入含200μmo1/LAS的IM培養(yǎng)基,26°C培養(yǎng)48h。懸浮沉淀,將該混合物涂布到KPYG2平板上(含200mg/L潮霉素B和200mg/L頭孢霉素),26°C培養(yǎng)直至抗性菌絲長出。

1.2.4潮霉素抗性基因hph的PCR檢測:引物hphR:5-TTCGATGTAGGAGGGCGTGGAT-3;hphF:5-CGCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3。分別以貴陽腐霉野生株和轉(zhuǎn)化株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增。PCR條件:94°C4min;94°C45s,60°Clmin,72°C1.5min,共35個循環(huán);72°C10min。

1.2.5Pr1蛋白酶活性測定:野生株和轉(zhuǎn)化株分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和基本鹽培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)液4°C、13000r/min離心,上清液即為粗酶液。利用專一性短肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA進(jìn)行Pr1蛋白酶活性測定[12]。酶活單位定義為在pH8.0、28°C條件下,每分鐘每毫克總蛋白的A410增加0.1所需的酶量?？捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白含量,計算比酶活。

1.2.6游動孢子的誘發(fā)與計數(shù):接種貴陽腐霉于KPYG2培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后,30mL滅菌蒸餾水中放入直徑15mm的2個菌絲塊,25°C靜置24h,輕搖燒瓶,取50μL液體并加入10μL棉藍(lán)染液,混勻,放置1015min。顯微鏡下計數(shù)游動孢子[2]。

1.2.7生物測定－滅蚊實驗:貴陽腐霉接種于KPYG2培養(yǎng)7d后。取塑料杯,盛入100mL水,加入25只二齡致倦庫蚊幼蟲和直徑為15mm的2塊菌絲塊,加入6滴4%兔肝粉懸液。設(shè)空白對照。每天觀察一次,取出死亡幼蟲鏡檢,體內(nèi)有菌絲者即為感染幼蟲;無菌絲者保濕培養(yǎng)24h再鏡檢,如有菌絲亦為感染。連續(xù)觀察10d[2]。

1.2.8感染蚊蟲酚氧化酶的測定:取貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株和野生株處理5d的蚊幼蟲各20只,加入pH6.0的磷酸鹽緩沖液1mL,冰上研磨。4°C、12000r/min多次離心,最終所得澄清液即為蚊蟲粗酶液。酚氧化酶活性測定:取粗提液100μL,再加入0.01mol/L反應(yīng)底物L(fēng)-DOPA100μL。一個酶活單位定義為室溫下每分鐘每毫克總蛋白的A490改變0.001所需的酶量。考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量,計算比酶活[13]。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.5電腦統(tǒng)計軟件分析處理。

2結(jié)果

2.1Pr1組成性表達(dá)載體pCambia-hph-Pr1的構(gòu)建與酶切驗證

按方法1.2.1擴增貴陽腐霉Pr1基因片段,獲得大小約1100bp的片段,與預(yù)期片段大小一致。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對與貴陽腐霉Pr1已知序列相同。按方法1.2.2構(gòu)建了以潮霉素抗性基因hph為篩選標(biāo)記,將目的基因Pr1置于真菌組成性啟動子PgpdA之下,構(gòu)建了表達(dá)載體pCambia-hph-Pr1(圖1)。用BamHⅠ酶切pCambia-hph-Pr1進(jìn)行驗證,切下大小分別約為16.3kb和2.8kb的條帶(圖2),與載體酶切位點和預(yù)期片段大小相符。將該載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株中,用于貴陽腐霉的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.2貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株的獲得及鑒定

按1.2.3方法,在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)23d,可見貴陽腐霉菌絲生長。隨機挑取這些潮霉素抗性菌絲轉(zhuǎn)接至新的含有200mg/L潮霉素B的選擇培養(yǎng)基上時,正常生長的菌絲體初步確定為轉(zhuǎn)化子。提取抗性菌株基因組DNA,以基因組DNA為模板,潮霉素抗性基因設(shè)計的引物進(jìn)行PCR檢測,電泳如圖3顯示,貴陽腐霉野生型菌株沒有擴增到特異性條帶,而抗性菌株均擴增到約780bp的目的條帶。

2.3貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株的穩(wěn)定性檢測

將轉(zhuǎn)化子在不含潮霉素B的KPYG2培養(yǎng)基上培養(yǎng),連續(xù)轉(zhuǎn)接10代,然后再接種到含有不同濃度潮霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),測量72h后菌落直徑[14]。貴陽腐霉野生株生長隨著潮霉素B濃度的增高受到抑制,當(dāng)潮霉素B濃度達(dá)到150mg/L時,生長完全受到抑制。貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株的生長情況與潮霉素B濃度無相關(guān)性,與野生株在非選擇培養(yǎng)基上的生長狀況無明顯差別(表1),表明轉(zhuǎn)化子是可以穩(wěn)定遺傳的。

2.4轉(zhuǎn)化株P(guān)r1蛋白酶分析

在含蟬蛻的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)化株的Pr1蛋白酶活性水平略高于野生株,但統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異。在含葡萄糖的基本鹽培養(yǎng)基(非誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的Pr1蛋白酶水平顯著高于野生型菌株(表2)。2.5貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株菌絲游動孢子產(chǎn)量統(tǒng)計學(xué)分析表明野生株與轉(zhuǎn)化株的游動孢子產(chǎn)量沒有顯著性差異(表3)。

2.6貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株滅蚊毒力檢測

轉(zhuǎn)化株的平均滅蚊效果比野生株滅蚊效果增強了近一倍,達(dá)到約33%,其中最高能達(dá)到約54.7%,兩者比較差異有顯著性意義。對蚊幼蟲化蛹率的統(tǒng)計分析表明,轉(zhuǎn)化株處理的幼蟲化蛹率顯著低于野生株和空白對照處理的幼蟲(表4)。死亡蚊幼蟲鏡檢觀察,對照組死亡蚊幼蟲尸體腫脹發(fā)白,表面無菌絲生長。野生株處理組死亡蚊幼蟲尸體彎曲,94%尸體表面有菌絲體生長。轉(zhuǎn)化株處理組死亡蚊幼蟲尸體明顯黑化,僅5.4%尸體表面可見菌絲體生長。

2.7貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株對蚊幼蟲體酚氧化酶活性的影響

貴陽腐霉野生株和轉(zhuǎn)化株處理的蚊幼蟲,其酚氧化酶活性顯著高于空白對照組,而轉(zhuǎn)化株處理的蚊幼蟲酚氧化酶活性數(shù)據(jù)高于野生株,但差異不顯著(表5)。

3討論

本實驗中獲得了遺傳穩(wěn)定的貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株,在非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中產(chǎn)生Pr1蛋白酶活性顯著高于野生株,說明轉(zhuǎn)入的Pr1蛋白酶基因在非誘導(dǎo)的條件下能夠組成性的表達(dá)。而在蟬蛻誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)化株的Pr1蛋白酶活性雖然在數(shù)據(jù)上要高于野生株,但統(tǒng)計學(xué)分析表明這種差異不顯著。這與方衛(wèi)國研究球孢白僵菌組成性表達(dá)類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1及幾丁質(zhì)酶基因Bbchit-1工程菌株的結(jié)果相似[15]。這有待于采用實時熒光定量PCR或者Western-Blotting等方法進(jìn)一步驗證,以檢測在基本鹽和誘導(dǎo)培養(yǎng)基的條件下,貴陽腐霉野生型菌株和轉(zhuǎn)化株P(guān)r1基因轉(zhuǎn)錄mRNA或表達(dá)Pr1蛋白酶水平的差異。游動孢子是貴陽腐霉產(chǎn)生的侵染蚊幼蟲的單細(xì)胞結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入的Pr1基因并未影響貴陽腐霉的產(chǎn)孢能力和生長能力。

2007年貴陽腐霉野生型菌株對致倦庫蚊幼蟲的生物測定顯示,其感染率為23.7%±13.0%[2],與最初分離時比較有顯著降低。而目前,貴陽腐霉野生型菌株對致倦庫蚊幼蟲的感染率僅為16.7%±13.0%。在長期實驗室人工傳代培養(yǎng)的過程中,菌株毒力退化明顯。因此我們期望采用菌株復(fù)壯、細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)等技術(shù)以提高菌株的毒力。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Pr1基因在貴陽腐霉的遺傳轉(zhuǎn)化方法,獲得的轉(zhuǎn)化株處理的蚊幼蟲死亡率明顯提高。我們推測了以下幾個原因:(1)在貴陽腐霉的野生型菌株,Pr1蛋白酶基因需要在昆蟲體壁的誘導(dǎo)下才能表達(dá),因此只有在游動孢子附著在昆蟲體壁上時,分泌Pr1蛋白酶作用昆蟲體壁局部。而轉(zhuǎn)化株可組成性表達(dá)Pr1蛋白酶,在游動孢子附著前可能已表達(dá)Pr1蛋白酶,而游動孢子附著后也誘導(dǎo)Pr1蛋白酶的產(chǎn)生,使其更快速入侵并萌發(fā)生長,耗竭昆蟲營養(yǎng)。(2)入侵后的轉(zhuǎn)化株在昆蟲血腔內(nèi)仍然組成性表達(dá)Pr1蛋白酶,可能破壞寄主的正常生理活動,降低其免疫力。(3)St.Leger提出在感染昆蟲晚期,當(dāng)酚氧化酶水平明顯降低的時候才在血淋巴中產(chǎn)生Pr1,顯示出酚氧化酶具有抵抗Pr1的蛋白水解作用[6]。在轉(zhuǎn)化株處理蚊幼蟲過程中,產(chǎn)生了更多的酚氧化酶,以抑制超表達(dá)的Pr1蛋白酶的水解作用,同時,酚氧化酶水平升高也導(dǎo)致了其氧化后醌水平的升高,引起蚊幼蟲醌中毒。

染病的蚊幼蟲,取食量下降,生長速度明顯減緩,最終死亡。轉(zhuǎn)化株處理的蚊幼蟲的酚氧化酶活性數(shù)值雖然高于野生株處理組,但是差異不顯著,這與St.Leger的結(jié)果不一致?？赡苁怯捎赟t.Leger采用直接注射Pr1蛋白酶,且煙草天蛾幼蟲體積大,易于獲取足量的血淋巴用于檢測,而蚊幼蟲(孑孓)體積小,難以獲得足夠測試數(shù)量的血淋巴。因而我們采用孑孓的整體研磨液,得到的粗酶液里包含了血漿、血細(xì)胞、表皮和組織中的PO,因此檢測的是總PO活性。這也可能是導(dǎo)致貴陽腐霉無論野生型抑或轉(zhuǎn)化菌株對蚊幼蟲的殺滅效率偏低的原因。