略說(shuō)DNA在牛桿菌中的穩(wěn)定性
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在EHA105和AGL－1中質(zhì)粒出現(xiàn)了明顯的降解。Song等研究發(fā)現(xiàn)土豆基因組DNA超過(guò)100kb的BIBAC和TAC克隆在農(nóng)桿菌中不穩(wěn)定，在同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)的土豆基因組片段中，45kb的片段不會(huì)出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象，遺傳穩(wěn)定。Shi等檢測(cè)了玉米中40～160kb的BIBAC克隆，無(wú)論在大腸桿菌中還是農(nóng)桿菌中都穩(wěn)定的遺傳。3．3受體材料的選擇處于不同發(fā)育狀態(tài)的受體材料對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感程度是不同的，但處于細(xì)胞分裂s期（DNA合成期）的核基因組DNA正在復(fù)制，這對(duì)于外源基因的整合十分有利，選擇此時(shí)期的細(xì)胞才具有整合外源基因的能力。細(xì)胞具有分裂能力是轉(zhuǎn)化的基本條件，創(chuàng)造出傷口的幼年組織細(xì)胞分裂快，處于轉(zhuǎn)化的敏感期，因此農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和再生的良好外植體來(lái)源是幼胚或經(jīng)成熟胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織，一般幼胚的轉(zhuǎn)化率略高于成熟胚。懸浮細(xì)胞系雖能活躍增殖，但其體細(xì)胞變異頻率大、轉(zhuǎn)化效率低，因而不適用于轉(zhuǎn)化。DNA與基因組的整合DNA作為外來(lái)者被整合到受體植物基因組中，出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)有所下降或者不表達(dá)等復(fù)雜現(xiàn)象。根據(jù)報(bào)道，外源基因被整合到受體植物基因組后，將產(chǎn)生以下幾種形式，一是外源基因插入到基因組的沉默區(qū)域內(nèi)，導(dǎo)致基因組內(nèi)沉默不表達(dá)的基因被激活而高效表達(dá)；二是外源基因隨機(jī)插入到基因組的閱讀框內(nèi)，使基因組正常核酸序列被破壞不能有效表達(dá)；三是外源基因插入到基因組的功能區(qū)內(nèi)，使其起調(diào)控的基因不能正常表達(dá)。等認(rèn)為帶有的BIBAC克隆能否在轉(zhuǎn)基因植物中整合特別是在遠(yuǎn)緣物種間的整合還需要深入研究。提高基因表達(dá)的策略根據(jù)基因表達(dá)的機(jī)理，可以通過(guò)創(chuàng)建高效表達(dá)的轉(zhuǎn)化載體來(lái)提高基因表達(dá)。一是構(gòu)建理想的人工啟動(dòng)子：構(gòu)建理想的人工啟動(dòng)子對(duì)的轉(zhuǎn)化十分必要，設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單快捷篩選強(qiáng)啟動(dòng)子的方法，可以快速篩選出恰當(dāng)長(zhǎng)度的啟動(dòng)子，為構(gòu)建理想的人工啟動(dòng)子提供了保障。二是對(duì)具有表達(dá)作用的內(nèi)含子序列進(jìn)行改造并插入。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子與基因表達(dá)有關(guān)，將單子葉植物基因的內(nèi)含子插入啟動(dòng)子和報(bào)告基因之間，可顯著提高基因在單子葉植物中的表達(dá)效率。為了能夠提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組織特異性，將擬南芥中H3組蛋白內(nèi)含子進(jìn)行改造，進(jìn)而達(dá)到了預(yù)期效果。三是根據(jù)受體材料的基因組情況對(duì)目的基因進(jìn)行改造。最典型的例子就是對(duì)基因的轉(zhuǎn)化，通過(guò)將其密碼子的第3個(gè)堿基進(jìn)行改造后，使其在植物中的毒蛋白表達(dá)量提高0．2％～0．3％。篩選標(biāo)記基因目前，大多數(shù)的篩選標(biāo)記基因是抗生素和除草劑抗性基因，快速并高效的篩選標(biāo)記基因是轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。He等通過(guò)BIBAC2載體攜帶2個(gè)穩(wěn)定的植物標(biāo)記基因潮霉素和新霉素成功轉(zhuǎn)化了水稻。此外，通過(guò)報(bào)告基因來(lái)篩選也比較快捷，但存在的問(wèn)題是報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)入的外源基因，有時(shí)并非發(fā)生在可再生細(xì)胞中，這樣則無(wú)法建立轉(zhuǎn)化體系。以上幾個(gè)為主要影響因素，此外還有一些因素也對(duì)DNA遺傳轉(zhuǎn)化有影響，如農(nóng)桿菌的生理活性、侵染時(shí)的菌液濃度、侵染后的培養(yǎng)時(shí)間、溫度、pH值等以及表面活性劑的使用情況等。
2結(jié)論與探討
可以將大基因組物種DNA有序的保存起來(lái)，通過(guò)將單個(gè)克隆保存在384板中，不僅減少后續(xù)研究中對(duì)DNA需求反復(fù)提取的繁瑣，也使后續(xù)試驗(yàn)操作變得簡(jiǎn)單快捷；對(duì)基因組而言，有序文庫(kù)比無(wú)序的片段要方便的多。其次，為基因組功能的研究、基因組測(cè)序及單個(gè)基因的克隆鑒定提供非常必要的操作平臺(tái)。DNA遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在基因簇轉(zhuǎn)移、多基因、代謝工程、基因圖位克隆、數(shù)量性狀座位等方面有重要意義，是植物遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)展趨勢(shì)，也是植物轉(zhuǎn)化的現(xiàn)實(shí)要求。但是目前國(guó)內(nèi)的DNA研究起步較晚成果較少，仍存在很多挑戰(zhàn)，如許多重要的經(jīng)濟(jì)作物、稀有物種對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化高度不親和性；轉(zhuǎn)化后外源基因在植株中能否穩(wěn)定的表達(dá)；如何提高轉(zhuǎn)化效率等，這些都是未來(lái)需要探討和深入研究的問(wèn)題。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)日趨成熟，所面臨的問(wèn)題會(huì)迎刃而解，DAN的未來(lái)會(huì)更光明。
作者：楊俊單位：東南職業(yè)技術(shù)學(xué)院
