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摘要：以淀粉為底物，通過麥芽糖基海藻糖合成酶（maltosyltrehalosesynthase,MTSase）和麥芽糖基海藻糖水解酶（maltosyltrehalosehydrolase,MTHase）兩種酶的共同作用生產海藻糖是一種經濟高效的方法。對ArthrobacterramosusS34來源并分別在E.coliBL21(DE3)中表達的MTSase和MTHase的酶學性質進行研究，發(fā)現(xiàn)MTSase的最適溫度為45℃，最適pH為7.0，MTHase的最適溫度為55℃，最適pH為6.0。隨后用2種酶共同作用生產海藻糖，優(yōu)化反應條件，考查反應溫度、初始pH、底物DE值、加酶量以及底物濃度等因素對酶轉化過程中海藻糖產率的影響。最佳酶轉化條件為反應溫度45℃、初始pH5.5，底物DE值8.5，加酶量分別為MTSase最小加量15.75U/g淀粉，MTHase最小加量7.5U/g淀粉。

關鍵詞：海藻糖；麥芽糖基海藻糖合成酶（maltosyltrehalosesynthase,MTSase）；麥芽糖基海藻糖水解酶（maltosyltrehalosehydrolase,MTHase）；酶學性質；酶轉化

海藻糖是一種在自然界中普遍存在的非還原性二糖，以穩(wěn)定的α,?1,1-糖苷鍵連接，不能被α-葡萄糖苷酶分解[1]。海藻糖無毒，作為糖類能夠為生物體提供能量和碳源。另有研究表明，當海藻糖與蛋白質、脂質、組織、器官等共存時，能夠幫助它們抵抗環(huán)境壓力，因此海藻糖還可用于生物物質的保存[2,3]。目前已有研究指出不同的酶系統(tǒng)可以有效地以麥芽糖，蔗糖和淀粉作為底物分別產生海藻糖[4-6]。1994年，有研究所發(fā)現(xiàn)2種不同的酶，麥芽糖基海藻糖合成酶（maltosyltrehalosesynthase,MTSase）和麥芽糖基海藻糖水解酶（maltosyltrehalosehydrolase,MTHase）在以淀粉作為反應起始底物時，在產生海藻糖的過程中起重要作用[7]。之后，又有研究人員報道了以蔗糖為底物通過三種不同的酶（海藻糖磷酸化酶，蔗糖磷酸化酶和葡萄糖異構酶）進行海藻糖代謝的合成[4]。1998年，經研究發(fā)現(xiàn)，通過海藻糖合酶可以使以α-1,4-糖苷鍵連接的麥芽糖重組轉變?yōu)橐驭??1,1-糖苷鍵連接的海藻糖，實現(xiàn)以麥芽糖為底物合成海藻糖[8,9]?？紤]工業(yè)應用中的成本因素，雙酶法所用的底物是比蔗糖和麥芽糖更便宜的淀粉，因此以MTSase和MTHase生產海藻糖是最具成本效益的方法。在雙酶法生成海藻糖的過程中，淀粉液化后，位于糊精末端的兩個葡萄糖分子間的α-1,4-糖苷鍵可在MTSase的催化下轉化為α,?1,1-糖苷鍵，使其變成帶有一分子海藻糖的糊精。此后，經MTHase的水解作用將其水解成兩部分，一部分為目標產物海藻糖分子，另一部分為減少兩個葡萄糖分子的糊精，而第二部分的糊精則作為底物參與下一輪反應，繼續(xù)生產海藻糖[7]。在國內外的相關研究中，已經對根瘤菌[10]，谷氨酸棒狀桿菌[11]，微黃短桿菌[6]，節(jié)桿菌[12]，分支節(jié)桿菌[7]，芝田硫化葉菌[13]以及嗜熱硫礦硫化葉菌[14]來源的MTSase和MTHase兩種酶基因進行了克隆表達，并對兩種酶的酶學性質及在生產海藻糖過程中的應用條件進行了研究。MTSase和MTHase兩種酶分別由基因treY和treZ控制表達，本實驗室于前期構建了分別含有treY和treZ的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treY和E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treZ，經過發(fā)酵優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)目的基因源自于ArthrobacterramosusS34的兩株基因工程菌的發(fā)酵酶活明顯高于已報道的該來源兩種酶的發(fā)酵酶活，具有較高的應用價值，相關論文目前還未發(fā)表。此來源的兩種酶在E.coliBL21(DE3)中的重組表達之前未有報道，因此本研究對這兩種重組酶的酶學性質以及在制備海藻糖過程中的條件優(yōu)化進行了研究。

1材料與方法

1.1材料與試劑，海藻糖、麥芽四糖、麥芽六糖購買于美國Sigma公司。

1.2儀器與設備，安捷倫1200高效液相色譜系統(tǒng)購買于美國Agilent公司。

1.3方法：

1.3.1MTSase和MTHase酶活力的測定MTSase酶活測定：10uL稀釋一定倍數(shù)的MTSase酶液（空白加高溫滅活的MTSase），加到190uL的10g/L的麥芽六糖溶液中（20mmol/LpH6.0的磷酸鹽緩沖液配制），45℃反應10min，100℃沸水中煮10min終止反應。取100uL反應液于10mL具塞試管中，注入900uL水和1mLDNS溶液，沸水中煮7min，加水補至10mL，最后在540nm波長下測定吸光度值。MTSase的酶活單位定義為：在45℃時，其他條件恒定，單位時間內每消耗1umol麥芽六糖所需的酶量。酶活公式：MTHase酶活測定：10uLMTSase濃縮酶液加到490uL10g?L-1的麥芽六糖溶液中（20mmol/LpH6.0的磷酸鹽緩沖液配制），45℃反應2h，100℃沸水中煮10min終止反應。待溶液冷卻后，加入10uL稀釋一定倍數(shù)的MTHase酶液（空白加高溫滅活的MTHase）到190uL的處理過的底物中，55℃反應10min，100℃沸水中煮10min終止反應，取100uL反應液，加入900uL水和1mLDNS溶液，沸水中煮7min，加水補至10mL，最后在540nm波長下測定吸光度值。MTHase的酶活單位定義為：在55℃時，其他條件恒定，單位時間內轉化生成1umol麥芽四糖所需的酶量。

1.3.2重組蛋白酶學性質的研究1.3.2.1重組MTSase和MTHase的最適溫度分別將底物置于35、40、45、50、55、60、65℃等不同溫度水浴中預熱3min，按照1.3.1所述方法測定酶活，算出百分比。定義最高酶活為100%。1.3.2.2重組MTSase和MTHase的溫度穩(wěn)定性將酶液置于45℃中保溫，定期取樣按照1.3.1操作步驟測定殘余酶活，算出百分比（設定0h酶活為100%）。1.3.2.3重組MTSase和MTHase的最適pH將酶液分別置于20mmol?L-1pH為4.0~8.0（梯度為0.5）的緩沖液中，在相應溫度下預熱3min，按照1.3.1所述方法測定相應pH條件下的酶活，算出百分比，定義最高酶活為100%。1.3.2.4重組MTSase和MTHase的pH穩(wěn)定性將酶分別置于20mmol/LpH4.0-8.0（梯度為0.5）緩沖液中，于4℃靜置24h，按照1.3.1操作步驟測定剩余酶活，算出百分比(設定0h酶活為100%)。1.3.3MTSase和MTHase制備海藻糖的工藝條件優(yōu)化1.3.3.1反應溫度的優(yōu)化200g/L的玉米淀粉液化至DE值10，初始pH為6.0，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，30U/g底物的MTSase和MTHase在150r/min的水浴搖床中進行反應。溫度分別設置為35、40、45、50、55℃，反應36h后終止反應并煮沸處理。產物稀釋沉淀后用液相測定其中海藻糖含量，算出產率。1.3.3.2底物DE值的優(yōu)化200g/L的玉米淀粉液化至DE值分別達到3.5、6.5、8.5和10.5，初始pH為6.0，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，30U/g的MTSase和MTHase在45℃，150r/min水浴搖床中反應36h后終止反應并煮沸處理。液相測定其中海藻糖含量，算出產率。1.3.3.3初始pH的優(yōu)化200g/L的玉米淀粉液化至DE值8.5，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，30U/g的MTSase和MTHase，分別調節(jié)初始pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0在45℃，150r/min水浴搖床中反應36h后終止反應并煮沸處理。測定其中海藻糖含量，算出產率。1.3.3.4加酶量的優(yōu)化200g/L的玉米淀粉液化至DE值8.5，初始pH為5.5，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，再分別加入終濃度為114、75.5、38、19、7.5、3.75、1.875U/g底物的MTHase和終濃度為31.5U/g底物的MTSase。另外分別加入終濃度為31.5、15.75、7.875、3.15、1.575U/g的MTSase和終濃度為114U/g底物的MTHase在45℃，150r/min水浴搖床中反應36h后終止反應并煮沸處理。液相測定其中海藻糖含量，算出產率。1.3.3.5底物含量的優(yōu)化分別配置170、240、270、320g/L的玉米淀粉作為底物，液化至DE值8.5，初始pH為5.5，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，30U/g底物的MTSase和MTHase在45℃，150r/min的水浴搖床中反應36h后終止反應并煮沸處理。測定其中海藻糖含量，算出產率。

1.3.4海藻糖轉化率的測定產物中的海藻糖含量采用高效液相色譜檢測，NH2柱，體積分數(shù)80%的乙腈溶液，流速為0.8mL/min，柱溫為40℃。1.3.5海藻糖轉化率的計算1.3.6優(yōu)化條件下反應過程中海藻糖產量的測定170g/L的玉米淀粉液化至DE值8.5，初始pH為5.5，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，15.75U/g底物的MTSase和7.5U/g底物的MTHase在45℃，150r/min的水浴搖床中反應。反應過程中每隔6h進行一次取樣并煮沸處理，36h后終止反應。測定其中海藻糖含量，算出產率。

2結果與討論

2.1重組MTSase和MTHase的酶學性質2.1.1重組蛋白最適溫度及溫度穩(wěn)定性蛋白酶的催化反應速率與反應溫度密切相關。如圖1示，MTSase的最適溫度為45℃，MTHase的最適溫度為55℃。在一定溫度范圍內，重組MTSase和MTHase的酶活性隨著溫度的升高也呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，由于過高的溫度會使蛋白質性質發(fā)生不可逆的改變，當溫度高于45℃時，MTSase的活性隨著溫度的升高開始降低；當溫度高于55℃時，MTHase的活性開始降低。MTSase和MTHase在45℃、50℃下的穩(wěn)定性結果顯示在圖2中。MTSase和MTHase在45℃的半衰期分別為96h和6h，在50℃的半衰期分別為50h和3h?？梢钥闯?，MTSase在45℃和50℃時具有較高的穩(wěn)定性，MTHase在兩種溫度下的穩(wěn)定性都比較差。2.1.2重組蛋白最適pH及pH穩(wěn)定性酶反應的反應速率會受到環(huán)境pH的影響。如圖3所示，MTSase在pH值5.5~8.0的范圍內均有70%以上的酶活，并在pH7.0的環(huán)境下，測得的酶活最高，大于或小于7.0的pH環(huán)境都會使酶活逐漸降低。MTHase的最適pH為6.0，在大于6.0的pH環(huán)境下，MTHase的活性急速降低，如當pH為6.5時，酶活相對值迅速降低至57.9%；而在小于6.0大于5.0的pH時，MTHase的酶活能夠穩(wěn)定在一定的范圍，達到酶活相對值85%以上；在更低的pH（<5.0）時，MTHase的酶活相對值則急速降低到42%以下。綜上，重組MTHase適合的pH范圍應為5.0~6.0。另外，pH穩(wěn)定性結果（圖4）表明，在4℃時，MTSase和MTHase在pH4.0~8.0均能保證較好的穩(wěn)定性。

2.2重組MTSase和重組MTHase制備海藻糖的工藝條件

2.2.1反應溫度與海藻糖轉化率的關系溫度會使酶的酶活性大小以及酶的穩(wěn)定性發(fā)生改變，從而改變海藻糖的產率。如圖5所示，在反應溫度逐漸升高時，海藻糖的轉化率也隨著提高，并在45℃時到達最高值，為54.2%。但在45℃之后，海藻糖的轉化率隨著溫度的升高快速下降，這可能是高溫使得MTHase快速失活而導致的。綜合以上因素，最終選擇45℃作為轉化產海藻糖的反應溫度。

2.2.2底物液化DE值與海藻糖轉化率的關系底物玉米淀粉液化結束時的DE值會對與海藻糖的轉化率之間也有著密切的聯(lián)系。如圖6所示，海藻糖的轉化率隨著DE值的升高而增加，并在DE值為8.5時達到最大值56.8%。這可能是因為在DE值過低時，糊化過的淀粉底物在溫度自然下降的過程中更易發(fā)生老化，使得淀粉內部已被破壞的分子氫鍵再次結合，隨著部分分子的有序排列，即造成結晶沉淀，從而使得底物利用率大大降低[15]。而當?shù)孜顳E值達到8.5時，更高的DE值代表著更低的聚合度，由于MTSase和MTHase在反應過程中只會對聚合度≧3的糖鏈起作用[7]，因此在一定范圍內，底物轉化成海藻糖的轉化率會隨著淀粉底物聚合度的降低而減少，因此，在DE值為8.5時，最適合進行底物制備海藻糖的反應。

2.2.3初始pH與海藻糖轉化率的關系由圖7可以看出，重組MTSase和重組MTHase轉化底物生成海藻糖的最適初始pH為5.5。初始pH低于5.5或過高時，海藻糖轉化率顯著降低，很可能是一方面過高或過低的pH使得酶活性中心的構象發(fā)生改變，甚至改變了酶分子的整體結構使其變形失活，導致酶分子的穩(wěn)定性大大降低；另一方面可能是不同pH會對酶活性中心附近相關基團的解離狀態(tài)產生一定的影響，造成活性部位與底物結合難易度的區(qū)別[16]。當初始pH處于5.5~6.5之間時，海藻糖轉化率也逐漸減少，可能是因為在該pH范圍內，不同pH導致酶穩(wěn)定性的變化，而這種變化對海藻糖產率的影響高于酶最適pH對其的影響。綜上考慮，選擇5.5作為反應的初始pH。

2.2.4加酶量與海藻糖轉化率的關系加酶量是影響海藻糖轉化率的重要因素，由于海藻糖的轉化需要MTSase和MTHase的共同作用，因此對兩種酶的加量進行了研究。如圖8所示，在加酶量充足的情況下，兩種酶的加量比例對海藻糖的轉化率沒有明顯的影響。在轉化過程中，如要保證一定的海藻糖轉化率，兩種酶都有對應的最少加量。如圖8（a），加入足量恒定的MTHase時，控制MTSase的加量，當其降低到15.75U/g時，依然能夠保持65%以上的轉化率，而當MTSase的加量降低到7.875U/g時，海藻糖轉化率則直接降低到55%。如圖8（b），加入足量恒定的MTSase時，控制MTHase的加量，在其加量≧7.5U/g時，海藻糖轉化率可始終穩(wěn)定在63%以上。因此，在酶轉化產海藻糖過程中，MTSase和MTHase的最少加量分別為15.75U/g和7.5U/g。

2.2.5底物濃度與海藻糖轉化率的關系為了提高工業(yè)生產中制備海藻糖的效率，研究了底物濃度對兩種酶共同作用生成海藻糖的轉化率的影響，分別在17%、24%、27%、32%四個不同的底物濃度下對其進行研究。結果（圖9）顯示，更高的底物濃度會伴隨有更低的海藻糖轉化率，其轉化率最高點在底物濃度為17%時達到，為67.7%。雖然海藻糖轉化率隨著底物濃度的升高而逐漸降低，但考慮到工業(yè)生產中進行一批生產所需的人力物力是一定的，因此在具體生產過程中，應對總體成本進行核算，以選取最佳底物濃度。

2.2.6優(yōu)化條件下海藻糖產量的過程研究經條件優(yōu)化后得知，MTHase和MTSase協(xié)同作用產海藻糖在45℃時能達到最高的產率?？紤]到MTHase在45℃時的半衰期為6h，因此在45℃下對海藻糖轉化進行過程研究。同時，作為對照，在反應進行到12h時，向反應體系中補加終濃度為7.5U/g底物的MTHase，繼續(xù)反應至36h。結果（圖10）表明，補加MTHase對海藻糖最終的轉化率沒有明顯提高。主要的轉化過程在前24h完成，在24h到30h的時間里，海藻糖含量的增速降低，但依然在增加，直到轉化進行到30h~36h之間時，海藻糖含量開始穩(wěn)定。這表明在整個反應過程中，MTHase均有著合適的酶活性來保證反應的進行，分析原因可能是當酶液與底物共同存在時，底物對MTHase具有保護作用。

3結論

本研究中重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treY和E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treZ能夠分別高效表達MTHase和MTSase，經研究發(fā)現(xiàn)，MTSase的最適溫度為45℃，最適pH為7.0，MTHase的最適溫度為55℃，最適pH為6.0。在兩種酶的產海藻糖應用研究中發(fā)現(xiàn)其最適轉化溫度和pH為45℃、初始pH5.5，這與其酶學性質研究結果相對應。另外，其最適底物DE值為8.5，過高和過低的DE值對其轉化率的影響都較大，因此后期在實際工廠生產中應嚴格控制底物淀粉的液化時間，以使其DE值達到8.5左右，保證海藻糖轉化率。在反應過程中，MTSase和MTHase最小加量分別為15.75U/g淀粉和7.5U/g淀粉，并且過量的兩種酶對海藻糖的轉化率都沒有明顯的影響。因此，在生產過程中，可以適當?shù)脑黾覯TSase和MTHase兩種酶的加量，保證反應的正常進行。最后，底物濃度對反應的進行也有著較大的影響，在其他條件恒定時，轉化率在一定范圍內隨著底物濃度的升高而降低。同時考慮到生產過程中的成本問題，應當結合具體情況，全面考慮以選擇最優(yōu)的底物濃度。綜上，本研究對兩種重組酶在海藻糖的生產中的應用，具有一定的指導作用。

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作者：王魁1，2宿玲恰1，2吳敬1，2陳晟1，2* 單位：1江南大學,食品科學與技術國家重點實驗室2,生物工程學院工業(yè)生物技術教育部重點實驗室