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【摘要】目的建立小柴胡片中柴胡皂苷a的含量測(cè)定方法。方法采用HPLC法，以固相萃取進(jìn)行樣品前處理，以Kromasil5C18（250mm×4.6mm，5μm）為色譜柱；以甲醇水（體積比75∶25）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。結(jié)果柴胡皂苷a的線性關(guān)系良好，回歸方程：A=358.09m-7.6102，r=0.9991；平均加樣回收率98.2%，RSD為1.92%。結(jié)論采用固相萃取能夠有效消除雜質(zhì)對(duì)柴胡皂苷a含量測(cè)定的影響；本法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，回收率高，可作為小柴胡片質(zhì)量控制的有效方法。

【關(guān)鍵詞】小柴胡片；柴胡皂苷a；高效液相色譜法；固相萃取

柴胡片收載于中國(guó)藥典2005年版一部中，由柴胡、半夏、黃芩等七味藥組成，具有解表散熱、疏肝和胃之功效，用于治療外感病、邪犯少陽(yáng)證有較好療效。中國(guó)藥典中以黃芩、甘草的TLC鑒別和黃芩苷的含量測(cè)定來(lái)控制本品的質(zhì)量［1］，而對(duì)于本品中的君藥，用量最大并起主要作用的柴胡卻沒(méi)有質(zhì)量控制指標(biāo)。

柴胡中柴胡皂苷a具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用［2］，是小柴胡片治療外感病，邪犯少陽(yáng)證的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，建立本品中柴胡皂苷a的含量測(cè)定方法，有助于更好的控制本品的質(zhì)量。但柴胡皂苷a的紫外吸收波長(zhǎng)在203nm，處于紫外末端，在測(cè)定時(shí)受雜質(zhì)干擾嚴(yán)重。固相萃?。⊿PE）是一種新的樣品前處理技術(shù)，近年來(lái)已經(jīng)應(yīng)用于中藥含量測(cè)定方法研究［3-5］，但還未見(jiàn)有將此方法應(yīng)用于柴胡皂苷a的含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用這種樣品前處理技術(shù)，有效地消除了本品中雜質(zhì)對(duì)柴胡皂苷a測(cè)定的影響，保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，具有操作簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間，回收率高的優(yōu)點(diǎn)，可用于小柴胡片的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

Agilent1100Series高效液相色譜儀（AgilentTechnologies,USA），AgilentChemStation4.0色譜工作站；SupelcleanENVI18SPEC18小柱（500mg/3mL，美國(guó)），Satorius電子分析天平（SartoriusCo.Ltd.Germany）；艾科普純凈水發(fā)生器。甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

柴胡皂苷a對(duì)照品（批號(hào)：110777-200301，供含量測(cè)定用）購(gòu)至中國(guó)藥品生物制品檢定所。小柴胡片（A廠，070102，070205，070408）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Kromasil5C18（250mm×4.6mm，5μm）；以甲醇水（體積比75∶25）為流動(dòng)相；流速為0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。理論塔板數(shù)按柴胡皂苷a峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。對(duì)照品圖譜、樣品圖譜、陰性對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖1。

A.柴胡皂苷a對(duì)照品；B.小柴胡片；C.陰性對(duì)照1.柴胡皂苷a

圖1HPLC色譜圖（略）

Fig.1HPLCchromatograms

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取柴胡皂苷a對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，搖勻，即得。

2.3供試品溶液的制備

取小柴胡片20片，研細(xì)，混勻，取約4g，精密稱定，加5%（體積分?jǐn)?shù)）氨水甲醇60mL，回流提取2次，合并2次提取液，濾過(guò)。水浴揮干，殘?jiān)铀?0mL溶解，加水飽和正丁醇萃取4次，每次20mL，合并正丁醇液，加氨試液洗滌2次，每次20mL，棄去氨洗液。正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?mL使溶解，加于已處理好的C18微柱（先用甲醇10mL沖洗，再用水10mL沖洗）上，分別用水10mL，80%(體積分?jǐn)?shù)）甲醇20mL洗脫，收集80%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇洗脫部分，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察

精密吸取上述對(duì)照品溶液8、10、12、16、20、25、30μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(m)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=358.09m-7.6102，r=0.9991。結(jié)果表明，在4.02～15.06μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24h注入液相色譜儀，測(cè)定,結(jié)果峰面積的RSD為1.05%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（070102）樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下制備成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果6份供試品含量的RSD為1.04%。表明本法的重復(fù)性良好。

2.7加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的小柴胡片粉末6份，按照供試品中柴胡皂苷a的量與對(duì)照品加入量1∶1的比例加入柴胡皂苷a對(duì)照品，分別制備供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定。以實(shí)測(cè)值與對(duì)照品加入量計(jì)算回收率。結(jié)果6份供試品的平均回收率為98.24%，RSD為1.92%，見(jiàn)表1。表明本方法回收率良好。

表1柴胡皂苷a加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（略）

Tab.1RecoverytestofSaikosaponiaa

2.8樣品測(cè)定

取3批樣品，照“2.3”項(xiàng)下制備成供試品溶液后，測(cè)定。結(jié)果3個(gè)批號(hào)070102、070205、070408樣品所測(cè)得的柴胡皂苷a含量分別為0.38、0.51、0.69mg/片。

3討論

3.1小柴胡片處方中有黃芩、黨參、甘草等藥材，既含有大量水溶性雜質(zhì)，又含有較多的親脂性雜質(zhì)。在提取柴胡皂苷a提取時(shí)也會(huì)提取出很多雜質(zhì)，干擾測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文采用與液相色譜柱填料相近的C18小柱進(jìn)行固相萃取，分別以水洗脫，除去水溶性雜質(zhì),再以80%(體積分?jǐn)?shù)）甲醇洗脫柴胡皂苷a，而將大量的親脂性雜質(zhì)保留在小柱上，從而有效地除去雜質(zhì)的干擾，保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2C18SPE小柱有100mg/3mL，500mg/3mL等多種規(guī)格。本文考察了100mg/3mL與500mg/3mL兩種規(guī)格對(duì)含量測(cè)定的影響，結(jié)果采用100mg/3mL小柱時(shí)，供試品的回收率只有72%左右，而采用500mg/3mL小柱時(shí)，回收率達(dá)到98.24%?？梢?jiàn)，SPE小柱的吸附容量會(huì)影響含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性?？赡苁怯捎跇悠分须s質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)性吸附導(dǎo)致柴胡皂苷a在100mg/3mL小柱上吸附不完全，而500mg/3mL小柱由于吸附容量增大，能夠完全吸附柴胡皂苷a，所以后者的回收率要明顯高于前者。提示在采用SPE小柱進(jìn)行樣品前處理時(shí)，要充分考察吸附容量對(duì)含量測(cè)定的影響。

3.3從本文結(jié)果看，不同批次小柴胡片中柴胡皂苷a的含量相差較大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同產(chǎn)地柴胡藥材中，柴胡皂苷a的含量相差1～5倍［6,7］，這可能是導(dǎo)致小柴胡片中柴胡皂苷a含量差異的主要原因。因此，有必要進(jìn)行藥材的GAP規(guī)范化種植，從而在原料上保證小柴胡片成品批間質(zhì)量的一致性。

【參考文獻(xiàn)】

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