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【摘要】目的探討人臍靜脈內皮細胞的原代培養(yǎng)方法，提高體外分離培養(yǎng)血管內皮細胞的成功率。建立血管內皮細胞培養(yǎng)模型，為體外研究血管內皮細胞提供實驗基礎。方法取2根臍帶（至少20cm）沖凈淤血，采用加工穿刺針固定臍靜脈灌注消化液,一根用0.2％膠原酶Ⅱ，另一根用0.1％膠原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比較兩種酶的消化效果。收集細胞并用含有10ng/mL的VEGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察細胞的生長及傳代。并在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學特點，同時用免疫組織化學的方法對所得細胞進行鑒定。用流式細胞術觀察細胞周期。結果兩種消化酶方法均獲得了相當數量的人臍靜脈內皮細胞，膠原酶Ⅱ的消化效果稍優(yōu)于混合消化酶，且比較理想的消化時間均為13min，細胞接種后4～5h開始貼壁生長，1周左右可生長成單層，光鏡下呈多角形，“鋪路石”樣排列，免疫組織化學法可見內皮細胞胞漿中人第Ⅷ因子相關抗原呈陽性反應。細胞周期顯示約有50.6%的細胞處于G0/G1期。結論膠原酶Ⅱ和膠原酶Ⅰ與胰酶等比混合消化液灌注法是獲得臍靜脈內皮細胞的一種可取方法，而膠原酶是分離培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞的首選消化液，成功率高，可靠性大，可成功構建體外研究血管內皮細胞的模型。

【關鍵詞】人臍靜脈內皮細胞；細胞培養(yǎng)；流式細胞術；細胞周期；分離；鑒定

Cultivationandinvitroidentificationofendothelialcellsfromhumanumbilicalvein

〔Abstract〕ObjectiveToexploretheprimaryculturemethodofhumanvascularendothelialcells(ECs)fromumbilicalvein,enhancethesuccessrateofseparatingandculturingECsinvitro,establishthemodelofhumanvascularECs,andprovideanexperimentalmethodforresearchofECs.MethodsTheumbilicalveinsinhumanumbilicalcords,20cmlong,werefixedandfilledthedigestivefluids,0.2%collagenenaseⅡinonecordandthecomplexenzymeof0.25%trypsinand0.1%collagenaseⅠinanother,andthedigestiveresultswerecompared.Allthecellswerecollectedandculturedinfluidwith10mg/mLVEGF,theirprocreationandgenerationwereobserved,themorphologiccharacteristicsofECswereobservedwithlightmicroscopyandimmunohistochemistryunderinvertedmicroscope,andthecellcyclewasobservedbyflowcytometer.ResultsEnoughECswereobtainedfrombothdigestiveliquids,andcollagenenaseⅡwasbetterthancomplexenzyme,theeffectivedigestingtimewas13minutes.theculturingcellsgrewonthewallappearedafter4-5hoursandthemonolayercellswereformedafteroneweek.ⅧfactorintheECsshowedpositivereactionbyimmunohistochemistry.Cellcyclerevealedthat50.6%cellswereatstageofG0/G1.ConclusionTheperfusionwithcolla〔Keywords〕humanvascularendothelialcellinumbilicalvein;cellculture;flowcytometry;cellcycle;separation;identification

血管內皮細胞是位于血管內壁的單層細胞，通過產生和分泌許多血管活性物質，在維持血管舒縮、抗凝血及血管構建等方面起重要作用，同時由于其特殊的解剖學部位使內皮細胞能敏感地感知血流、壓力、炎癥信號以及血液循環(huán)中激素水平的變化，通過一系列的信號轉導過程與鄰近及遠處的細胞相互聯(lián)系，對各種刺激作出反應，維持機體內外環(huán)境的穩(wěn)定。內皮細胞的體外培養(yǎng)是研究內皮細胞生物學與多種疾病關系的重要方法。新生兒臍帶由于取材方便，來源充足，而成為血管內皮細胞體外實驗的主要材料。本文利用健康產婦正常娩出的胎盤端游離臍帶，采用改進的灌注消化法，運用不同的消化酶成功分離了人臍靜脈內皮細胞，并用免疫組織化學法進行了鑒定，從而為構建體外研究血管內皮細胞的模型及進一步實驗研究打下了基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源與采集標本均來自于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產科正常足月妊娠娩出的新生兒臍帶。于無菌條件下剪下臍帶（至少20cm）放入裝有培養(yǎng)基的無菌容器中，快速移入實驗室，1h內行臍靜脈內皮細胞的分離培養(yǎng)。

1.1.2試劑PRMI-1640培養(yǎng)基、類標準胎牛血清（Hyclone)；L-谷氨酰胺（Sigma公司）；VEGF（Sigma公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；膠原酶Ⅰ、Ⅱ（Gibco公司）；兔抗人Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；青-鏈霉素（Gibco公司）；其它試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器水套式CO2培養(yǎng)箱（2300型，SHEL-LAB）；超凈工作臺（SW-CJ-IF，蘇州安泰空氣技術公司）；臺式多管自動平衡離心機（TDZ5-WS，長沙平凡儀器儀表有限公司）；倒置顯微鏡（XD-101型，南京江南光電股份有限公司）；制冰機（AF100型，斯科茨曼公司）；超純水儀（MaximaScientific，ELGA公司）；電熱重蒸水器（ZLSC，上海申安醫(yī)療器械廠）；座式自控電熱壓力蒸氣滅菌器(ZDX-35型，上海申安醫(yī)療器械廠)；電子分析天平（AB204N型，梅特勒－托力多有限公司）；流式細胞儀（BECTONDickinson）。

1.2方法

1.2.1人臍靜脈內皮細胞的原代分離及培養(yǎng)將取來的臍帶迅速移入潔凈操作臺內，無菌條件下將其放入提前盛有預熱PBS培養(yǎng)皿中，剪去有鉗夾痕及血腫的部分，擠出臍帶中的血，用剪刀修齊兩斷面，分成20cm的一段。找出臍靜脈（2根管腔較細的是臍動脈，1根管腔較粗的是臍靜脈），用帶平針頭的注射器從一端插入臍靜脈，血管鉗固定，再用預熱的PBS沖洗3次以上，將血跡完全沖洗干凈。為防止臍動脈殘留的血液混入，可將動脈分離少許用消毒線結扎，用止血鉗鉗夾另一端。從沖洗的針頭中注入0.1%膠原酶Ⅱ使其充盈，另一條以同樣的方法注入0.1%膠原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液。取出針頭，用止血鉗夾住注入端，移入無菌燒杯中，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育13min。取出，松開注入端的血管鉗，收集臍靜脈內的消化液，然后注入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液再次沖洗管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1000r/min，離心5min，棄上清，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液（含20%胎牛血清，10ng/mLVEGF。L-谷氨酰胺2mmoL/L,青霉素100U/mL,鏈霉素100mg/mL）,用巴氏吸管輕輕吹打均勻，按1×106個接種于培養(yǎng)瓶，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液去除未貼壁的細胞，然后每隔24h半定量換液1次至細胞生長鋪滿瓶底。

1.2.2人臍靜脈內皮細胞的傳代培養(yǎng)待細胞生長融合成單層細胞后，棄去培養(yǎng)液，加入0.125%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液2～3mL，倒置顯微鏡下觀察，當細胞回縮變圓后棄去消化液，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液5～10mL終止消化，用巴氏吸管吹打制成細胞懸液，按1∶2或1∶3比例將細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3人臍靜脈內皮細胞的形態(tài)學觀察及鑒定細胞換液后直接在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及生長特征，并作相差攝影，同時進行常規(guī)HE染色觀察并攝片。鑒定采用DAB免疫組織化學法，在6孔培養(yǎng)板中放置載玻片，玻片上植入2mL含有1×106的細胞懸液，待細胞貼壁后，取出載玻片，放入-20℃的冷丙酮中固定30min,用PBS沖洗3次，每次2min,滴加3%H2O2室溫孵育10min，PBS沖洗3次，每次2min,以消除內源性過氧化物酶的活性。滴加兔抗人Ⅷ因子相關抗原多抗工作液，放入濕盒內4℃過夜，同時另一蓋玻片不加一抗作陰性對照。次日，用PBS沖洗3次，每次2min,滴加辣根酶標記的羊抗兔IgG,37℃孵育30min,PBS沖洗3次，每次2min，用DAB底物混合工作液顯色，顯微鏡下觀察，待出現(xiàn)特異性染色后，終止顯色，進行復染，脫水，透明，封片，相差顯微鏡下觀察攝影。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期將消化所得的細胞懸液1000r/min離心5min，棄去上清，用PBS洗3次，加入-20℃預冷的70%乙醇，調整細胞數量大于106以上，重懸、固定12h以上，取1mL細胞懸液，用PBS洗3次，細胞重懸于1mL的PI染液中，37℃孵育30min進行流式分析，檢測細胞周期。

2結果

2.1人臍靜脈內皮細胞的形態(tài)學觀察

相差倒置顯微鏡下觀察，人臍靜脈內皮細胞貼壁單層生長，呈短梭狀或鋪路石樣鑲嵌排列，細胞為扁平多角形，邊界清楚，胞漿豐富（見圖1-B、C）。胞核清晰可見，為圓形或橢圓形。原代培養(yǎng)細胞，于接種后2h開始貼壁生長（見圖1-A），傳代細胞約0.5h后即開始貼壁生長。原代細胞1周左右可長滿，傳代細胞生長旺盛，有時可見多核細胞。

2.2Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學鑒定

人臍靜脈內皮細胞Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學染色可見細胞呈圓形、梭形或多邊形，胞漿內可見棕黃色顆粒（見圖1-D），核周密集，而對照組內未見著色。證實培養(yǎng)的細胞為內皮細胞。

2.3流式細胞術檢測人臍靜脈內皮細胞的細胞周期

結果顯示S期的細胞約有36.5%，S+G2+M期的細胞約有47.6%活躍于增殖期，而處于G0/G1期的細胞約占有50.6%左右（見圖2），臺盼藍排除實驗示活細胞的百分比為94.5%，換3個視野算平均值為92.3%。

3討論

新生兒臍帶來源充足，取材、操作方便可行。且臍靜脈在許多方面具有與動脈相似的生物學特性。因而，臍靜脈內皮細胞成為血管內皮細胞體外實驗的主要材料。成功地獲得大量臍靜脈內皮細胞，是體外建立血管內皮細胞模型的保證。

在培養(yǎng)細胞的獲取上，多采用機械刮取法和酶消化法。機械刮取法是將臍靜脈剪開，用手術刀背等刮取內皮細胞或使用帶有尼龍篩的分離管[1]，但這一方法很難掌握力度，易損傷內皮細胞，而且多混有其它細胞如成纖維細胞等?，F(xiàn)多采用酶消化法，胰蛋白酶、膠原酶均可作為消化血管內皮細胞的酶，但膠原酶的性較溫和，效果較好。尤其膠原酶Ⅱ可認為是消化臍靜脈內皮細胞的理想酶[2]，價格較昂貴。胰蛋白酶價廉，但對細胞有毒性作用。在本實驗中我們選用膠原酶Ⅱ和膠原酶Ⅰ與胰蛋白酶等比混和消化液，消化13min，均成功獲取了足夠量的血管內皮細胞，但膠原酶Ⅱ獲取的細胞數量要稍多于混合消化液，不過混合消化酶也不失為一種可取的消化液。因此選用合理的消化酶并掌握好消化時間，是成功獲取內皮細胞的關鍵之一。同時，標本材料的新鮮程度也影響獲得內皮細胞的數量。有研究表明[3]，臍靜脈內皮細胞離體后，隨著時間的延長，細胞內一些物質的含量會發(fā)生變化，如離體超過6h，內皮細胞第Ⅷ因子相關抗原釋放量以及前列環(huán)素生長量均隨著存放時間的延長而呈下降趨勢，時間超過12h后，細胞會出現(xiàn)水腫、變性，活力下降，甚至無法存活。還有研究表明[4]，臍帶離體3h內內皮細胞存活率為90%，離體24h后僅有50%存活。本試驗于1h內進行消化和原代分離培養(yǎng)，細胞數量多增殖良好。培養(yǎng)基的pH值也是影響細胞生長的因素之一。內皮細胞生長最適pH7.2～7.4，起初可稍低（7.0左右），這樣易于貼壁生長。提前用多聚賴氨酸預包被培養(yǎng)瓶也有助于細胞的貼壁。細胞營養(yǎng)液血清的選擇也是決定血管內皮細胞能否存活的決定因素。高質量的各種血清均能保證內皮細胞的正常生長，有試驗結果顯示[5-6]：高質量的胎牛血清對人臍靜脈血管內皮細胞的生長有良好的促進作用，是體外成功培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞的關鍵。我們在實驗中選用類標準胎牛血清，細胞生長良好。

人臍靜脈內皮細胞體外生長能力較差，增殖緩慢，原代培養(yǎng)不易成功，傳代培養(yǎng)也只能傳3～4代，在內皮細胞培養(yǎng)過程中加入適量的生長刺激因子，這些因子有高效特異的促有絲分裂作用，可明顯促進細胞生長[7]。我們在總結失敗經驗的基礎上，在完全培養(yǎng)液中加入10ng/mL的VEGF，成功傳代8代后，細胞仍然生長良好。

人臍靜脈內皮細胞相對其他血管內皮易分離取得，經濟實用，成功獲取大量的人臍靜脈內皮細胞，為體外研究建立血管內皮提供實驗模型，為進一步研究血管內皮的生物學特性及其與各種疾病的關系打下基礎。

【參考文獻】

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