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十八大感想范文第1篇

【關(guān)鍵詞】  靶向線粒體轉(zhuǎn)錄因子a·rna干擾·慢病毒載體·模型，動(dòng)物·大鼠，wistar

establishment of experimental aminal model of rnai in vivo using lentivirus-sirna vector system targeting tfam

lin heng, tang chun, wu qiao, feng chun-lin, zhang yu-jun, bie ping

hepatobiliary surgery institute, southwest hospital, third military medical university （chongqing 400038, china）

【abstract】 objective: to construct a recombinant lentivirus vector of rna interference targeting mitochondrial transcription factor a （tfam） gene and to select the most efficient small interfering rna （sirna） to suppress tfam in target cells, and  to use the selected lentivirus vector in vivo and to analyze its efficacy. methods: according to genbank information of tfam, four sirna and double strand dna were designed, synthesized and inserted into the lentivirus vector. the recombinant lentivirus vector system was confirmed by pcr and sequencing, then it was used to transfect the target cells. the change of tfam expression was determined by pcr and western blot. the most efficient lentivirus vector was selected and used in vivo. the change of tfam expression in liver was assessed. results: the results of enzyme digestion and sequencing showed that the recombinant lentivirus vector was constructed successfully. the result of rt-pcr showed that target 3#  had the highest interfering. efficiency （about 55%） and western blot analysis confirmed its efficacy. the result of rnai in vivo also proved its efficiency. conclusion: the recombinant lentivirus vector of rna interference targeting tfam has been successfully constructed. it can effectively suppress tfam expression in vitro and in vivo.

【key words】 mitochondrial transcription factor a·rna interference·lentiviral vector·rats,wistar

rna干擾（rna interference，rnai）可用于生物學(xué)研究和藥物研制，并可作為疾病的一種治療手段?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些有治療作用的sirna［1］，但sirna如何有效地進(jìn)入體內(nèi)并傳遞到合適的靶器官和靶細(xì)胞尚不明確，文獻(xiàn)報(bào)道，用于活體內(nèi)傳遞sirna的方法包括化學(xué)修飾形成共軛體（如脂質(zhì)體）［2］、與多肽、聚合物或抗體結(jié)合形成復(fù)合物［3］以及用病毒作為載體等。

本研究設(shè)計(jì)合成靶向線粒體轉(zhuǎn)錄因子a（mitochondrial transcription factor a，mttfa，tfam）的sirna，并利用慢病毒載體系統(tǒng)將體外實(shí)驗(yàn)篩選出的有效sirna通過(guò)門(mén)靜脈傳輸至大鼠肝臟，觀察其體內(nèi)的干擾活性，從而構(gòu)建出大鼠活體rna干擾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為下一步實(shí)驗(yàn)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　動(dòng)物來(lái)源及分組

健康wistar大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量180～250 g。動(dòng)物分為陽(yáng)性病毒組（實(shí)驗(yàn)組）、陰性病毒對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組。

1.2　實(shí)驗(yàn)材料

慢病毒包裝細(xì)胞293t細(xì)胞株、大腸桿菌菌株dh5α、及大鼠肝星狀細(xì)胞株（hsc－t6）均由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司提供；慢病毒載體系統(tǒng)由pgc－lv載體、phelper1.0載體和phelper2.0載體3種質(zhì)粒組成。taq多聚酶購(gòu)自日本takara公司；lb培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)atcc公司；大量質(zhì)粒dna抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)qiagen公司；限制性內(nèi)切酶ageⅰ、ecorⅰ、t4 dna連接酶及其緩沖液均購(gòu)自美國(guó)neb公司；m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶、dntp、rna酶抑制劑均購(gòu)自美國(guó)promega公司；pcr用試劑、引物購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司；胰酶購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司；胎牛血清、dmem、rpmi1640及opti－mem均購(gòu)自美國(guó)gibco公司；脂質(zhì)體lipofect2000、總rna提取試劑trizol均購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；山羊抗tfam、小鼠抗gapdh、抗山羊igg、抗小鼠igg均購(gòu)自美國(guó)santacruz公司；bca protein assay kit購(gòu)自美國(guó)hyclone-pierce公司；ecl-plus/kit購(gòu)自美國(guó)amersham公司。

1.3　方法

1.3.1　構(gòu)建慢病毒載體

針對(duì)目的基因tfam的基因序列，利用公用網(wǎng)站按照rna干擾序列的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了4個(gè)sirna的寡核苷酸序列（命名為target1#、target2# 、target3# 和target4#，具體序列見(jiàn)表1），并進(jìn)行慢病毒載體的構(gòu)建（雙鏈dna具體序列見(jiàn)表2），然后運(yùn)用t4連接酶與經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶ageⅰ、ecorⅰ雙酶切后的pgc－lv載體連接，用氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株dh5α，最后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行pcr鑒定并進(jìn)行測(cè)序分析。pcr鑒定陽(yáng)性克隆的引物信息如下：上游引物：5’-cctatttcccatgattccttcata-3’，下游引物：5’-gtaatacggttatccacgcg-3’。

1.3.2　慢病毒載體包裝及滴度測(cè)定

產(chǎn)毒細(xì)胞為293t細(xì)胞，將合成好的4個(gè)重組慢病毒質(zhì)粒及輔助包裝載體質(zhì)粒進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，按照l(shuí)ipofectamine2000使用說(shuō)明共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞。轉(zhuǎn)染8 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液進(jìn)行濃縮和收獲，將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，－80 ℃長(zhǎng)期保存。取其中1支進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定，方法為孔稀釋法。具體病毒濃縮收獲及滴度測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[4]。

1.3.3　慢病毒感染目的細(xì)胞hsc－t6

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的靶細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為2×104），接種于12孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5%co2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%；根據(jù)moi值（moi=10，moi表示病毒數(shù)與細(xì)胞數(shù)量的比值），加入適宜量的病毒，12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)。如果沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基；感染3 d后觀察慢病毒上報(bào)告基因gfp的表達(dá)情況，感染效率>50%者繼續(xù)培養(yǎng)，待感染時(shí)間達(dá)到5 d后收集細(xì)胞抽提rna進(jìn)行rt-pcr檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，感染7 d后收集細(xì)胞并采用western blot的方法檢測(cè)目的基因蛋白水平的表達(dá)；感染效率<50%的實(shí)驗(yàn)組，重新進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為6組：con為正常目的細(xì)胞，未感染任何病毒的細(xì)胞組，nc為正常目的細(xì)胞，加陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞組，kd為正常目的細(xì)胞，加rnai靶點(diǎn)病毒感染的細(xì)胞組，1～4標(biāo)示待篩選靶點(diǎn)病毒的序號(hào)。

1.3.4　目的細(xì)胞中tfam rnai效果檢測(cè)

1.3.4.1　rt－pcr檢測(cè)目的細(xì)胞tfam mrna水平表達(dá)的變化情況

取各組細(xì)胞用trizol法抽提總rna，然后根據(jù)promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。取1μl作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，tfam上游引物：5’-agaaacgcctaaagaagaaagc-3’，下游引物：5’-ttccaagcctgatttacaagc-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物166 bp；內(nèi)參照actin上游引物：5’-cggcattgtcaccaactg-3’，下游引物：5’-cgctcggtcaggatcttc-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物約369 bp。pcr反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、15 s，之后每一步變性95 ℃、5 s，退火延伸60 ℃、30 s；共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每次在延伸階段讀取吸光度值。制作熔解曲線：pcr結(jié)束后，95 ℃變性1 min，然后冷卻至55 ℃，使dna 雙鏈充分結(jié)合。從55 ℃開(kāi)始到95 ℃，每一步增加0.5 ℃，保持30 s, 同時(shí)讀取吸光度值。real-time pcr數(shù)值分析采用2-δδct分析法。

1.3.4.2　western blot檢測(cè)目的細(xì)胞tfam蛋白水平表達(dá)的變化情況

用2×lysis buffer（裂解液）冰上裂解細(xì)胞10～15 min，裂解液配方如下：1 mol/l tris-hcl（ph=6.8）100 mm、巰基乙醇 2％、甘油20％及sds 4％。測(cè)定蛋白濃度后，將每個(gè)樣品蛋白終濃度均調(diào)整為2 g/l。各組取相同量總蛋白，采用sds-page電泳法電泳，濕轉(zhuǎn)至pvdf膜，用含5％脫脂牛奶的tbst溶液封閉pvdf膜，山羊抗tfam抗體（1∶200）、小鼠抗gapdh抗體（1∶5 000）與封閉好的pvdf膜室溫孵育2 h，tbst洗膜，相應(yīng)二抗（1∶5 000）室溫孵育pvdf膜2 h，tbst洗膜，最后采用ecl法進(jìn)行顯色。利用圖像處理軟件quantity one4.62對(duì)蛋白電泳圖片進(jìn)行分析，分別測(cè)定目的蛋白條帶和內(nèi)參照的吸光度值，并以二者的比值作為目的蛋白的相對(duì)定量結(jié)果。

1.3.5　大鼠活體rnai動(dòng)物模型的建立

擬通過(guò)門(mén)靜脈將慢病毒載體注入大鼠肝臟，為了保證慢病毒在大鼠體內(nèi)的感染效率，我們?cè)谧⑸渎《局斑M(jìn)行了全肝血流阻斷并參考文獻(xiàn)[5]的做法將阻斷時(shí)間定為20 min。具體方法如下：

1）實(shí)驗(yàn)組大鼠腹部用8％na2s脫毛，手術(shù)野用碘伏消毒，整個(gè)手術(shù)過(guò)程在雙人雙目顯微鏡下操作。進(jìn)行全肝血流阻斷時(shí)，先結(jié)扎右腎上腺靜脈，然后依次阻斷肝后下腔靜脈、肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈的血流，全肝血流阻斷后立即通過(guò)門(mén)靜脈注射rna干擾慢病毒載體（5×107 tu/只），阻斷20 min后恢復(fù)血流。

2）陰性病毒對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組手術(shù)步驟基本上和實(shí)驗(yàn)組相同，不同的是門(mén)靜脈分別注射的是陰性對(duì)照病毒和生理鹽水。

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，麻醉采用乙醚吸入麻醉，術(shù)后自由進(jìn)食水。各組觀察時(shí)相點(diǎn)為術(shù)后4、7、14 d，保證每時(shí)相點(diǎn)每組存活大鼠6只。

1.3.6　目的基因tfam活體rnai效果檢測(cè)

1.3.6.1　肝組織細(xì)胞感染慢病毒

術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)取大鼠肝臟組織，制成1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的組織塊，用oct包埋劑包埋后反復(fù)多次于液氮中凍存（每次凍存時(shí)間為3～5 s），直至組織標(biāo)本和包埋劑一起凍存成形，置于－80 ℃保存?zhèn)溆?；將包埋好的?biāo)本切片，厚度為7 μm，置－20 ℃保存；切片取出后風(fēng)干半小時(shí)，然后置于－20 ℃預(yù)冷的丙酮中4 ℃固定8 min；pbs洗3次，5 min /次；甩去多余的水分，dapi（1∶100）染核，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞感染情況。

1.3.6.2　rt－pcr檢測(cè)肝組織中tfam mrna水平表達(dá)的變化情況

取各組液氮保存的肝組織標(biāo)本，玻璃勻漿器制成勻漿后用trizol法抽提組織總rna，將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。取1 μl作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)。tfam上游引物：5’-taccctcgcctgtcagccttatct-3’，下游引物：5’-cacttcgcccaacttcagccattt-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物597 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物：5’-atcatgtttgagaccttcaaca-3’，下游引物：5’-catctcttgctcgaagtcca-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物約318 bp。pcr反應(yīng)條件基本同前。real-time pcr數(shù)值分析采用2-δδct分析法。

1.3.6.3　western blot檢測(cè)肝組織中tfam 蛋白表達(dá)的變化情況

取100 mg液氮保存的肝組織，加入1 ml ripa和10 μl pmsf（不能預(yù)先加入到ripa中，否則pmsf失去效能）冰上研磨組織塊，研磨時(shí)避免起泡沫和發(fā)熱；將樣品轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管，4 ℃、2 000 r/min離心30 min；將上清小心轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，取部分測(cè)定蛋白濃度，其余-20 ℃ 保存?zhèn)溆?。其余?shí)驗(yàn)步驟及分析方法基本同前。

2　結(jié)果

2.1　陽(yáng)性克隆的pcr鑒定

靶向tfam的shrna寡核苷酸序列經(jīng)退火形成雙鏈dna，與經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶ageⅰ、ecorⅰ雙酶切后的pgc－lv載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行pcr鑒定。陽(yáng)性克隆pcr產(chǎn)物大小為343 bp，而空載組pcr產(chǎn)物大小為306 bp，鑒定結(jié)果與預(yù)期一致。測(cè)序結(jié)果顯示4個(gè)靶點(diǎn)均插入正確（圖1，2）。2.2　慢病毒包裝及滴度測(cè)定　使用重組慢病毒載體pgc-lv和慢病毒包裝質(zhì)粒phelper1.0和phelper2.0共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，48 h后收集病毒粗提液進(jìn)行濃縮，命名為lenti-target1#、lenti-target2#、lenti-target3#和lenti-target4#。然后利用孔稀釋法分別測(cè)定4個(gè)靶點(diǎn)的病毒滴度，結(jié)果依次為8×107、7×107、9×107和1×108 tu/ml，病毒包裝成功符合下一步需要。

2.3　體外目的細(xì)胞中tfam rnai效果檢測(cè)

2.3.1　rt－pcr檢測(cè)目的細(xì)胞中tfam的干擾效果

rt－pcr結(jié)果顯示，各組目的細(xì)胞tfammrna相對(duì)表達(dá)量（2-δδct）分別為，con：0.794±0.016；nc：1.002±0.075；kd1：0.853±0.063kd2：0.913±0.149；kd3：0.465±0.052；kd4：0.899±0.071。4個(gè)靶點(diǎn)中3號(hào)靶點(diǎn)對(duì)目的基因tfam的表達(dá)有明顯干擾效果，干擾效率在55％左右（p<0.05）。

2.3.2　western blot檢測(cè)tfam蛋白水平的變化

western blot結(jié)果證實(shí)3號(hào)靶點(diǎn)病毒感染hsc-t6細(xì)胞后，tfam蛋白水平的表達(dá)明顯減弱，因此，該靶點(diǎn)是有效的rna干擾靶點(diǎn)（圖3，4）。

2.4　目的基因tfam活體內(nèi)rna干擾結(jié)果

2.4.1　肝組織感染病毒情況

通過(guò)肝組織冰凍切片觀察到，門(mén)靜脈注射慢病毒4 d后，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中就可以見(jiàn)到感染了慢病毒（帶綠色熒光）的肝組織細(xì)胞（細(xì)胞核為藍(lán)色，圖5）；一直到膽道再通術(shù)后14 d，第3組大鼠肝組織中都可以見(jiàn)到感染了慢病毒的肝組織細(xì)胞。對(duì)心、脾、肺和腎等其它組織器官的觀察可以發(fā)現(xiàn)這些組織細(xì)胞并沒(méi)有感染慢病毒。

2.4.2　肝組織中目的基因tfam mrna水平的變化

rt－pcr結(jié)果顯示，術(shù)后4 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中目的基因tfam的表達(dá)較2個(gè)對(duì)照組明顯降低（p<0.05），干擾效率在45％左右，而兩個(gè)對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至術(shù)后2周，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中tfam的表達(dá)仍然被明顯抑制（p<0.05），說(shuō)明在體外合成篩選的慢病毒載體在大鼠肝組織中能夠較穩(wěn)定的表達(dá)，并滿足下一步實(shí)驗(yàn)的需要。

2.4.3　肝組織中目的基因tfam蛋白水平的變化

western blot結(jié)果顯示，門(mén)靜脈注射慢病毒后第4天，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中tfam蛋白表達(dá)也出現(xiàn)明顯下降（圖6）；至術(shù)后2周，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中tfam蛋白的表達(dá)仍然明顯低于兩個(gè)對(duì)照組，這一趨勢(shì)與rt－pcr的結(jié)果一致，證明慢病毒載體在實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中能夠穩(wěn)定表達(dá)并保持了良好的干擾活性。

3　討論

tfam是影響線粒體dna（mitochondrial dna，mtdna）最重要的核編碼因子之一，在mtdna的表達(dá)調(diào)控中處于中心位置，是mtdna維持穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄所必須的因子。對(duì)mtdna的作用主要有以下幾點(diǎn)：促進(jìn)mtdna的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)［6-7］；提高mtdna的拷貝數(shù)量［8］；修復(fù)受損的mtdna［9］；促進(jìn)細(xì)胞的增殖及分化［10］。前期研究中發(fā)現(xiàn)，膽道梗阻后，重組人肝再生增強(qiáng)因子（recombinant human augmenter of liver regeneration，rhalr）對(duì)大鼠肝細(xì)胞線粒體功能及肝功能有明顯的保護(hù)作用；當(dāng)膽道再通后，給予rhalr的大鼠，其肝功能及線粒體功能恢復(fù)更快［11］。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，rhalr發(fā)揮作用可能與tfam有關(guān)：膽道梗阻后，rhalr能夠降低tfam mrna表達(dá)量的下降；膽道再通后，rhalr能夠促進(jìn)tfam mrna表達(dá)量的增加。因此，筆者推測(cè)rhalr可能通過(guò)誘導(dǎo)梗阻性黃疸大鼠肝細(xì)胞tfam的表達(dá)，提高線粒體dna的拷貝數(shù)，保護(hù)及修復(fù)損傷的線粒體dna，從而最終發(fā)揮其對(duì)阻塞性黃疸大鼠線粒體功能和肝功能的保護(hù)作用。為了證明此推測(cè)，我們?cè)趧?dòng)物活體上進(jìn)行tfam的rnai，觀察rhalr的保護(hù)作用是否依然存在。

sirna病毒載體系統(tǒng)中，常見(jiàn)的病毒載體有慢病毒、腺病毒和森林腦炎病毒等。其中慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組分和特性。利用慢病毒構(gòu)建的sirna載體，與化學(xué)合成的sirna和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的shrna相比，它可以用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)?；谙乱徊絼?dòng)物活體rnai實(shí)驗(yàn)的需要，我們選擇了慢病毒作為sirna的載體。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3號(hào)靶點(diǎn)在mrna和蛋白水平上都能明顯降低tfam的表達(dá)，在設(shè)計(jì)的4個(gè)靶點(diǎn)中效率最高，達(dá)到了55％左右，且病毒滴度也滿足下一步實(shí)驗(yàn)的需要。進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體外篩選出的有效干擾慢病毒載體通過(guò)門(mén)靜脈注入大鼠肝臟后4 d，通過(guò)觀察肝組織冰凍切片可以發(fā)現(xiàn)感染了慢病毒的肝臟細(xì)胞（其他組織器官中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)綠色熒光的慢病毒），rt-pcr和western blot的結(jié)果也都提示目的基因tfam的表達(dá)明顯降低，干擾效率在45％左右；至術(shù)后2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中目的基因tfam的表達(dá)仍然明顯低于2個(gè)對(duì)照組。結(jié)果說(shuō)明，以慢病毒作為載體將sirna通過(guò)門(mén)靜脈途徑傳輸?shù)礁闻K后保證了其感染的特異性，體外篩選出的有效干擾靶點(diǎn)在體內(nèi)同樣保持了較好的干擾效果。因此，本實(shí)驗(yàn)篩選出的靶向tfam的有效sirna序列，構(gòu)建的慢病毒載體傳輸系統(tǒng)及建立的大鼠活體rnai動(dòng)物模型，為下一步研究rhalr保護(hù)阻塞性黃疸大鼠肝功能的作用機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；同時(shí)，也為其他需要將tfam作為研究對(duì)象進(jìn)行rnai的研究提供了參考。

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