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反向遺傳學(xué)研究方法范文第1篇

這本教材由最近一次的流感大流行開(kāi)始引出了目前流感研究中有待解決的問(wèn)題，例如，病毒起源、傳播、發(fā)病機(jī)制、疾病的嚴(yán)重程度等。本教材還涵蓋了多領(lǐng)域最新流感研究進(jìn)展，包括基因組學(xué)、能夠識(shí)別病毒毒力的反向遺傳學(xué)、1918年西班牙流感病毒株的分析重建等。

本書(shū)共分為8章：1.流感緒論，敘述了人類(lèi)流感病毒以及流感大暴發(fā)的歷史。2.流感病毒的結(jié)構(gòu)與復(fù)制，分別講述了流感病毒的結(jié)構(gòu)、裝配過(guò)程、基因組、病毒的復(fù)制、病毒編碼蛋白、甲流乙流的質(zhì)子通道、宿主與病毒功能的調(diào)控、流感病毒復(fù)制和PB1F2的結(jié)構(gòu)和功能、發(fā)病機(jī)制等。3.流感病毒的進(jìn)化與生態(tài)學(xué)，分別通過(guò)感染不同宿主的流感病毒詳述了其變異及進(jìn)化知識(shí)；4.流行病調(diào)查；5-6.詳述了流感的免疫學(xué)，詳細(xì)介紹了先天免疫、抗體介導(dǎo)免疫、細(xì)胞介導(dǎo)免疫、免疫原性、流感疫苗、動(dòng)物流感防控、流感疫苗生產(chǎn)；7.臨床與抗藥性方面的知識(shí)，包括致病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、最新的抗藥性研究、流感病毒模型的構(gòu)建；8.介紹了最近一次H7N9暴發(fā)的情況和研究進(jìn)展。

本書(shū)不僅詳細(xì)形象地闡述了流行性感冒的歷史、流感病毒的病原學(xué)、流行病學(xué)以及實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)基礎(chǔ)，更突出流感病毒研究的最新進(jìn)展、成果以及國(guó)際關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。本書(shū)的寫(xiě)作深入淺出、通俗易懂，力求既能涵蓋全面的流感基礎(chǔ)知識(shí)，又能反映現(xiàn)階段流感研究的發(fā)展水平。

本書(shū)作為全面介紹流行性感冒的專業(yè)教材，既滿足各高等學(xué)校醫(yī)學(xué)類(lèi)、生物類(lèi)、生物工程類(lèi)學(xué)科本科教學(xué)的需求，同時(shí)也滿足不同層次和其他相關(guān)專業(yè)研究生的教學(xué)需要。

馬雪征，碩士，助理研究員

反向遺傳學(xué)研究方法范文第2篇

反向遺傳技術(shù)為在DNA水平上對(duì)RNA病毒進(jìn)行研究和操作提供了極為方便有用的工具。本研究構(gòu)建了EV71全長(zhǎng)cDNA克隆,并將體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞,成功獲得拯救病毒,為進(jìn)一步研究EV71病毒基因功能、基因變異與病毒毒力關(guān)系、基因疫苗等研究以及防控該病奠定良好的基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1毒株與細(xì)胞

EV71病毒株FJ08149是2008年從一手足口病病例皰疹液分離獲得,經(jīng)鑒定為EV71 C4基因亞型。RD細(xì)胞由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心脊灰實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑

長(zhǎng)片段擴(kuò)增Primescript RT-PCR Kit購(gòu)自Takara公司;PCR-XL- TOPO TA載體 購(gòu)自Invitrogen公司;RiboMAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7 購(gòu)自Promega 公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit、Transfection reagent和RNeasy Mini kit 購(gòu)自Qiagen公司;EV71單克隆抗體購(gòu)自Chemicon公司;FITC標(biāo)記的二抗購(gòu)自Dako公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)FJ08149株的序列和酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,上游引物 EV71-5T7在其5'引入T7啟動(dòng)子序列及NotI酶切位點(diǎn),下游引物EV71-3RM在其5'端引入52個(gè)Poly(T)及MluI酶切位點(diǎn)。由Takara公司合成。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增基因片段

按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑說(shuō)明提取病毒RNA,最后用適量無(wú)RNA酶的雙蒸水溶解。根據(jù)長(zhǎng)片段Primescript RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū),先以EV71-3RM為反轉(zhuǎn)錄引物,在42℃反應(yīng)1小時(shí)反轉(zhuǎn)錄全長(zhǎng)cDNA,然后利用Takara Ex Taq HS進(jìn)行基因組全長(zhǎng)擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;98℃ 10sec , 68℃ 9min,40個(gè)循環(huán);72℃ 10min。反應(yīng)產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖中電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.4 全長(zhǎng)cDNA 的構(gòu)建與鑒定

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后純化,以TA克隆方法將帶有T7啟動(dòng)子識(shí)別序列的基因組全長(zhǎng)連入TOPO-XL-PCR載體中,用MluI和NotI酶切鑒定是否插入目的片段。

1.5 體外轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞

用MluⅠ和NotI將有目的片段插入的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切線性化,純化后按照T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明在體外轉(zhuǎn)錄出RNA,用RNeasy mini kit(Qiagen)試劑盒進(jìn)行RNA純化后,加30ul無(wú)RNA酶的雙蒸水洗脫, 定量。按照Transfection reagent說(shuō)明書(shū)要求把RNA轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)于6孔細(xì)胞板RD細(xì)胞中, RNA含量為2μg/孔。轉(zhuǎn)染后每天觀察細(xì)胞,待細(xì)胞病變(CPE)達(dá)到75%及以上或觀察7天后,收獲細(xì)胞進(jìn)行鑒定與傳代。

1.6 拯救病毒的鑒定

1.6.1 RT-PCR鑒定及VP1序列測(cè)定

用EV71-S(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’)和EV71-A(5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’)診斷引物對(duì)拯救病毒進(jìn)行鑒定。應(yīng)用EV71-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACT

TCAC-3’)和EV71-R (5’-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC -3’)擴(kuò)增包括VP1全長(zhǎng)在內(nèi)的1082bp產(chǎn)物,并進(jìn)行序列測(cè)定分析。

1.6.2間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定

CPE達(dá)到75%及以上或觀察7天后,收集細(xì)胞及上清,2500rpm離心10min,取細(xì)胞沉淀用無(wú)菌PBS洗2次后,重懸細(xì)胞沉淀,滴加到熒光片,用丙酮將其固定,蒸鎦水清洗1次后加入EV71單克隆抗體,37℃濕盒中孵育1 h,PBS 洗滌3次。加入用1∶6000伊文斯蘭以1∶40 稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗,37℃濕盒中孵育1h,PBS洗滌3 次后甘油封孔,鏡檢。

1.6.3拯救病毒效價(jià)測(cè)定

獲得拯救病毒經(jīng)RD細(xì)胞傳一代擴(kuò)增后,與母本病毒同時(shí)進(jìn)行TCID50測(cè)定。詳細(xì)方法及步驟參見(jiàn)《WHO脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[3]。

1.6.4電鏡觀察

獲得拯救病毒經(jīng)RD細(xì)胞傳一代擴(kuò)增后,反復(fù)凍融3 次,4500r/min 離心30 min,取上清濃縮5倍后,以1%加入EV71特異性抗體37 ℃孵育2h后,4℃過(guò)夜,10000r/min離心30 min,以PBS重懸沉淀,點(diǎn)樣、負(fù)染,電鏡觀察。

2結(jié)果

2.1 全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建

利用引物EV71-5T7和EV71-3RM,從FJ08149病毒上清擴(kuò)增出EV71基因組全長(zhǎng)約7.5kb,見(jiàn)圖1A(marker不夠清晰)。應(yīng)用TA克隆技術(shù),將EV71基因組全長(zhǎng)連接入PCR-XL-TOPO TA載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,經(jīng)MluI和NotI雙酶切鑒定,FJ08149T5和FJ08149T25兩個(gè)克隆質(zhì)粒均有目的基因插入,見(jiàn)圖1B,目的基因約7.5kb,載體大小為3.5kb。

A: FJ08149株基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1.RT-PCR擴(kuò)增后的全基因組產(chǎn)物(7.5kb);2.DNA Marker DL15,000;3. 陰性對(duì)照。B: TA 克隆NotI和MluI雙酶切鑒定結(jié)果;1.DNA Marker DL15,000;2.pFJ149T5;3.pFJ149T25

圖1基因組PCR產(chǎn)物及TA克隆酶切鑒定

2.2 體外轉(zhuǎn)錄制備感染性RNA

應(yīng)用MluI和NotI雙酶切,從pFJ08149T5和pFJ08149T25克隆質(zhì)粒中切下含有T7啟動(dòng)子的基因組DNA。并將此片段作為體外轉(zhuǎn)錄模板,通過(guò)T7 RNA聚合酶系統(tǒng),體外轉(zhuǎn)錄成RNA,經(jīng)電泳鑒定,轉(zhuǎn)錄的RNA達(dá)到預(yù)期的7.5Kb大小,見(jiàn)圖2。

1.RNA Marker RL10,000 2. pFJ08149T5 3.pFJ08149T25

圖2體外轉(zhuǎn)錄RNA電泳圖

2.3 病毒的拯救

轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后72小時(shí),即可見(jiàn)到典型的腸道病毒CPE,見(jiàn)圖3A,CPE呈逐日增多,7天后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清以20%比例傳代,第3天CPE達(dá)到75%以上。對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)7天均仍保持正常形態(tài),見(jiàn)圖3B。

A.轉(zhuǎn)染pFJ08149T5后的RD細(xì)胞B. 正常的RD細(xì)胞

圖 3RNA轉(zhuǎn)染RD后CPE形態(tài)

2.4 拯救病毒的鑒定

2.4.1間接免疫熒光鑒定

拯救病毒、拯救病毒傳1代后和母本病毒株用EV71單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),均可見(jiàn)到特異性的熒光,見(jiàn)圖4A,而細(xì)胞對(duì)照無(wú)熒光產(chǎn)生,見(jiàn)圖4B。

圖4拯救病毒的間接免疫熒光鑒定

2.4.2RT-PCR鑒定及序列分析

拯救病毒培養(yǎng)上清用EV71-A和EV71-S、EV71-F和EV71-R進(jìn)行擴(kuò)增,均得到預(yù)期大小的目的片段,約226bp和1082bp,見(jiàn)圖5。將VP1全長(zhǎng)序列測(cè)定分析,拯救病毒與母本病毒891個(gè)堿基完全一致。

圖5 拯救病毒的RT-PCR鑒定

2.4.3拯救病毒毒力效價(jià)測(cè)定

將拯救病毒與母本病毒同時(shí)進(jìn)行病毒效價(jià)測(cè)定,結(jié)果pFJ08149T5的效價(jià)為105.25TCID50/0.1ml,pFJ08149T25效價(jià)為107.25TCID50/0.1mL,母本病毒FJ08149的效價(jià)為107.505TCID50/0.1mL。其中pFJ08149T25與母本病毒對(duì)細(xì)胞的感染力相近,而pFJ08149T5約低100倍。

2.4.4病毒粒子的形態(tài)

濃縮后的FJ08149T5拯救病毒與EV71抗體作用后,形成免疫復(fù)合物,經(jīng)負(fù)染色,電鏡下觀察到球形病毒粒子,直徑約22nm,見(jiàn)圖6。

圖6拯救病毒的免疫電鏡

3討論

自1981年Racaniello VR和Baltimore D 首次應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功拯救出脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)后[4],翻開(kāi)了RNA病毒研究的新篇章,實(shí)現(xiàn)了在DNA水平上研究RNA病毒。通過(guò)構(gòu)建cDNA感染性克隆,應(yīng)用DNA基因操作方法,如定點(diǎn)突變、重組、缺失和嵌合等手段,研究拯救病毒基因水平的改變對(duì)表型的影響,進(jìn)而達(dá)到對(duì)病毒基因功能與結(jié)構(gòu)、致病機(jī)制、表達(dá)調(diào)控、分子免疫機(jī)理等的全面認(rèn)識(shí),開(kāi)發(fā)出新型疫苗。日本學(xué)者Arita等,于2005年首先構(gòu)建了EV71標(biāo)準(zhǔn)株BrCr的感染性克隆,然后利用基因置換,引入PV疫苗株(Sabin I)影響溫度敏感與病毒毒力的突變位點(diǎn),在猴子模型上證實(shí)了溫度敏感的病毒株對(duì)猴子毒性減弱[5];2008年,他們又在NOD/SCID鼠模型中證實(shí)了幾個(gè)決定溫度敏感的突變位點(diǎn)在神經(jīng)毒力減弱中起協(xié)同作用[6]。2008年以來(lái)EV71在中國(guó)大陸流行,迫切需要利用本土流行株構(gòu)建感染性克隆,為研究其致病機(jī)理、病毒變異與毒力關(guān)系以及疫苗的研究提供技術(shù)支持。

由于PV等小RNA病毒的基因組是單股正鏈RNA分子,裸RNA分子就具有感染性,且基因組較小,如EV71等腸道病毒屬僅有7.5Kb大小,無(wú)帽子結(jié)構(gòu)。理論上構(gòu)建其感染性克隆可能較為容易,但在實(shí)際操作中仍然面臨著不少的困難。首先需獲得完整基因組的cDNA序列,先前基本上采取分段擴(kuò)增后逐步克隆拼接出完整的cDNA序列,操作過(guò)程煩瑣,且多次克隆、連接也給基因序列突變?cè)黾恿藱C(jī)率。本研究中通過(guò)長(zhǎng)片段RT-PCR一次性擴(kuò)增出全長(zhǎng)基因組,一次克隆操作以盡量減少可能引入序列變異。第二,基因組3’端需有足夠長(zhǎng)的Poly(A)尾,一定長(zhǎng)度的Poly(A)對(duì)維持基因組穩(wěn)定性及保證其感染性均有作用[7]。據(jù)報(bào)道,PV的Poly(A)如果少于20個(gè),RNA的感染性比野生株會(huì)低20倍[8]。Sarnow等對(duì)3’端Poly(A)組成不同對(duì)PV體外轉(zhuǎn)錄本感染性影響的研究得到,Poly(A)尾越長(zhǎng)其感染性越接近野生株,但非同源聚合序列反而使其感染性降低[7]。本研究設(shè)計(jì)時(shí)利用3’端引物直接帶入52個(gè)Poly(A)尾和一個(gè)MluI酶切位點(diǎn),達(dá)到保證感染性同時(shí)可進(jìn)行線性化的目的。第三,保證基因組忠實(shí)性,減少其它非基因組序列引入。本研究直接將T7啟動(dòng)子特異性識(shí)別序列通過(guò)引物精確加到基因組5’端,并帶入NotI酶切位點(diǎn),轉(zhuǎn)錄前通過(guò)雙酶切,避免將載體序列引入。第四,克隆擴(kuò)增時(shí)如何避免因細(xì)菌增殖可能引起的序列變異,導(dǎo)致序列缺失或插入從而導(dǎo)致基因組序列不完整性。在本研究過(guò)程中也曾發(fā)現(xiàn)過(guò)類(lèi)似的情況,因此采用了28℃、150rpm/min的低溫低轉(zhuǎn)速的優(yōu)化培養(yǎng)條件,這是乙型腦炎病毒等其它感染性克隆構(gòu)建過(guò)程也曾采取的措施[9]。本研究還發(fā)現(xiàn)如果基因組正向插入到載體T7啟動(dòng)子下游,不僅細(xì)菌增殖緩慢且量少,質(zhì)?？截悢?shù)低,且轉(zhuǎn)染也無(wú)感染性;而如果基因組以反向插入,則細(xì)菌不僅增殖快量大,質(zhì)?？截悢?shù)高,且所獲得的幾株感染性克隆均為此反向插入的。這是否因不同方向插入時(shí),潛在表達(dá)的蛋白質(zhì)不同導(dǎo)致的,有待于進(jìn)一步深入研究分析。

本研究應(yīng)用本地分離株成功地構(gòu)建了中國(guó)大陸流行C4基因亞型EV71感染性克隆,轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞成功獲得了拯救病毒,經(jīng)鑒定與野生株具有相似的遺傳特性與生物學(xué)性狀。此感染性克隆構(gòu)建成功,可為下游研究提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn):

[1] Lin TY, Twu SJ, Ho MS, et al .Enterovirus 71 outbreaks, Taiwan: occurrence and recognition. Emerg Infect Dis. 2003,9: 291293.

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[3] 世界衛(wèi)生組織.脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)[R].第4版.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心:北京, 2004:78-96.

[4] Racaniello VR, Baltimore D.Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in Mammalian cells. Science. 1981,214(11):916-919.

[5] Arita M, Shimizu H, Nagata N, et al. Temperature-sensitive mutants of enterovirus 71 show attenuation in cynomolgus monkeys. J Gen Virol. 2005,86:1391-1401.

[6] Arita M, Ami Y, Wakita T, et al. Cooperative effect of the attenuation determinants derived from poliovirus sabin 1 strain is essential for attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model. J Virol, 2008,82(4):1787-1797.

[7] Sarnow P.Role of 3’-end sequences in infectivity of poliovirus transcripts made in vitro. J Virol, 1989, 63(1):467-470.

反向遺傳學(xué)研究方法范文第3篇

【關(guān)鍵詞】 慢病毒

Construction and identification of lentiviral vector of RNA interference of Smad4 gene

【Abstract】 AIM: To construct a lentiviral vector of RNA interference (RNAi) of Smad4 gene. METHODS: The effective sequence of siRNA targeting Smad4 gene was confirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed， synthesized and cloned into the pLVTHM vector， which contained H1 promoter and green fluorescent protein (GFP). The resulting lentiviral vector containing Smad4 shRNA was named LVshSmad4， and it was confirmed by PCR and sequencing. 293T cells were cotransfected with lentiviral vector LVshSmad4，pCMVdR8.74 and pMD2G. All virus stocks were produced by calcium phosphatemediated transfection. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. RESULTS: PCR and DNA sequencing demonstrated that the lentivirus RNAi vector of Smad4 (LVshSmad4) producing Smad4 shRNA was constructed successfully. The titer of concentrated virus was 5×1010 pfu/L. CONCLUSION: The lentivirus RNAi vector of Smad4 was constructed successfully.

【Keywords】 RNA interference; Smad4; Neoplasms; Lentivirus

【摘要】 目的：構(gòu)建Smad4基因RNAi慢病毒載體. 方法：針對(duì)已經(jīng)篩選確定的Smad4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM載體［含H1啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白（GFP）］連接產(chǎn)生LVshSmad4慢病毒載體，PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定. 用LVshSmad4，pCMVdR8.74和pMD2G 3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，以293T細(xì)胞GFP蛋白的表達(dá)水平測(cè)定病毒滴度. 結(jié)果：PCR和測(cè)序證實(shí)，成功構(gòu)建Smad4 shRNA的慢病毒載體LVshSmad4. 包裝慢病毒，濃縮病毒懸液的滴度為5×1010 pfu/L. 結(jié)論：成功構(gòu)建人Smad4基因RNAi慢病毒載體.

【關(guān)鍵詞】 RNA干擾；Smad4；腫瘤；慢病毒

0引言

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)Smad信號(hào)途徑在腫瘤發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用. Smad4（deleted in pancreatic carcinoma locus 4， DPC4）在信號(hào)傳輸途徑中處于中樞地位，活化的RSmads與Smad4結(jié)合成寡聚物，將TGFβ的信號(hào)傳遞到核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)［1］. 近年來(lái)，RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術(shù)的出現(xiàn)，為研究?jī)?nèi)源性基因功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了強(qiáng)有力的研究工具. 我們?cè)谝呀?jīng)獲取Smad4基因的RNAi有效靶序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)、構(gòu)建和鑒定表達(dá)Smad4 siRNA的慢病毒載體，為后期研究Smad4基因在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制和基因治療打下基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料采用慢病毒的包裝細(xì)胞293T細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞所）、大腸桿菌菌株DH5α，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶（Invotrogen公司）. 慢病毒載體系統(tǒng)（Tronolab公司tronolab.com/lentivectors.php）. 該病毒包裝系統(tǒng)由pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G 3質(zhì)粒組成，其中pLVTHM含有能持續(xù)表達(dá)小RNA的元件，同時(shí)能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）. pCMVdR8.74和pMD2G含有病毒包裝所必須的元件. 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、大量質(zhì)粒DNA提取試劑盒（Qiagen公司).

1.2方法

1.2.1構(gòu)建表達(dá)shRNA慢病毒載體用Ambion公司的設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)、合成3對(duì)針對(duì)Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列. 經(jīng)分別構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，據(jù)其對(duì)Smad4的抑制率，確定有效靶序列：5′GTACTTCATACCATGCCGA3′，（Smad4 mRNA第1848位，GenBank gi：34147555）. 設(shè)計(jì)并合成（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司）其shRNA的DNA Oligo：5′CGCGTCCCCGTACTTCATACCATGCCGATTCAAGAGA

TCGGCATGGTATGAAGTACTTTTTGGAAAT3′（內(nèi)含MluI和ClaI酶切位點(diǎn)，下劃線所示tronolab.com/lentivectors.php）. 經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)MluI和ClaI雙酶切后的pLVTHM載體連接，轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌，挑取重組陽(yáng)性克隆行PCR及測(cè)序鑒定（上海博亞生物技術(shù)有限公司）. PCR鑒定陽(yáng)性克隆的primer: Up: 5′GTGTCACTAGGCGGGAACAC3′；Down: 5′TTATTCCCATGCGACGGTATC3′.

1.2.2慢病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，細(xì)胞密度為0.5×109/L時(shí)，重新接種于25 mL的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)轉(zhuǎn)染. 制備慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒DNA溶液（LVshSmad4 20 μg，pCMVdR8.74 15 μg，pMD2G 7.5 μg），無(wú)菌水定容至1800 μL， 再加入CaCl2 (2.5 mol/L) 溶液200 μL，混勻，加入2×BBS緩沖鹽溶液2000 μL，室溫放置20～30 min. 將DNA磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，培養(yǎng)12 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液，加入PBS 15 mL，輕搖后棄去，重復(fù)該步驟3次. 然后每瓶細(xì)胞中加入含100 mL/L小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液15 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h. 收集轉(zhuǎn)染72 h的293T細(xì)胞上清液. 于4℃，4000 g離心10 min；以0.45 μm濾器過(guò)濾后置于40 mL超速離心管中，4℃，25 000 r/min離心20 min；而后以冰PBS液重旋病毒沉淀，于4℃溶解過(guò)夜. 次日，以10 μL每管分裝病毒液置于-70℃冰箱中保存. DMEM培養(yǎng)液重懸293T細(xì)胞至5×108/L， 在96孔板每孔中加100 μL重懸細(xì)胞. 取6個(gè)eppendorf管，每管中加入90 μL預(yù)熱的OptiMEM培養(yǎng)基， 加10 μL病毒顆粒于第1管，混勻，從第1管取10 μL混合液于下一管，混勻；依次稀釋病毒顆粒至第6管；將96孔板中培養(yǎng)基吸出，每孔加45 μL病毒顆粒稀釋液，37℃溫育8 h后，更換含100 mL/L FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng). 倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP表達(dá)量，計(jì)算病毒滴度.

轉(zhuǎn)貼于 　　2結(jié)果

2．1陽(yáng)性克隆的PCR鑒定Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列，經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)MluI和ClaI雙酶切后的pLVTHM載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取重組陽(yáng)性克隆，行PCR鑒定陽(yáng)性克隆. 重組細(xì)菌克隆的PCR產(chǎn)物277 bp（插入片段為67 bp），以經(jīng)雙酶切后沒(méi)有插入片段的pLVTHM空載體PCR產(chǎn)物210 bp為對(duì)照（圖1），鑒定結(jié)果與預(yù)期相符. 測(cè)序結(jié)果表明合成的Smad4 shRNA寡核苷酸鏈序列插入正確（123~189），此時(shí)命名慢病毒重組載體為L(zhǎng)VshSmad4(圖2).

M：Marker；1：對(duì)照；2：重組細(xì)菌克隆的PCR產(chǎn)物.

圖1PCR鑒定陽(yáng)性克隆（略）

2．2慢病毒載體的包裝及滴度測(cè)定提取獲得500 μg重組質(zhì)粒. 將慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察各孔中GFP的表達(dá)量，病毒滴度為表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù). 測(cè)定滴度為5×1010 pfu/L，說(shuō)明有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，病毒成功包裝.

3討論

近年來(lái)TGFβSmad信號(hào)通路在惡性腫瘤中的研究是腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)［1］. Smad4扮演抑癌基因的作用［2-4］. 利用Smad4在TGFβSmad通路中的處于中樞環(huán)節(jié)的機(jī)制，沉默敲除或者恢復(fù)Smad4，再研究其下游調(diào)節(jié)基因表達(dá)變化和生物學(xué)特性的改變，是倍受重視的研究思路［1］. RNAi技術(shù)的出現(xiàn)，成了一種新的反向遺傳學(xué)手段被廣泛地應(yīng)用于基因功能分析、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究和基因治療. 質(zhì)粒介導(dǎo)RNAi有一定的局限性，轉(zhuǎn)染率低，基因抑制表達(dá)作用弱，持續(xù)時(shí)間短［2-5］，不適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn). 慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以HIV1為基礎(chǔ)發(fā)展而得，具有許多優(yōu)點(diǎn)，能夠轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞，而且病毒的遺傳物質(zhì)能夠整合到宿主的基因組，將其用于腫瘤的基因治療，除比其他病毒載體更具優(yōu)勢(shì)外，病毒的VSVG外殼使載體病毒顆粒具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，慢病毒載體RNAi作用持久，同時(shí)擴(kuò)大了載體感染細(xì)胞的范圍. 因此慢病毒載體是很有前途的基因治療載體. 最近，用慢病毒載體介導(dǎo)RNAi的幾項(xiàng)體內(nèi)外研究［6-8］即顯示了該技術(shù)策略在內(nèi)源性基因功能研究和基因治療前沿領(lǐng)域的重大意義.

基于目前尚無(wú)將RNAi技術(shù)應(yīng)用于肝細(xì)胞癌Smad4的研究報(bào)道， 我們?cè)诤Y選出Smad4基因RNAi的有效靶序列后，構(gòu)建表達(dá)shRNA慢病毒載體，以進(jìn)一步研究沉默Smad4基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響并探討其機(jī)制. 為構(gòu)建Smad4 shRNA慢病毒載體，購(gòu)買(mǎi)了病毒包裝系統(tǒng)pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G質(zhì)粒. 其中，pLVTHM質(zhì)粒中含有H1啟動(dòng)子，能在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)siRNA，同時(shí)該質(zhì)粒能表達(dá)由EF1（Elongation Factor）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP，可用于病毒包裝時(shí)轉(zhuǎn)染效率及感染目的細(xì)胞的感染效率的檢測(cè). pCMVdR8.74質(zhì)粒中含有HIV病毒的Gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；Pol基因，編碼病毒特異性的酶；Rev基因，編碼調(diào)節(jié)Gag和Pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子. pMD2G質(zhì)粒中含有單純皰疹病毒來(lái)源的VSVg基因，提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白. 293T細(xì)胞是293細(xì)胞的一種，作為包裝細(xì)胞，在包裝后產(chǎn)生了高滴度的病毒顆粒，同時(shí)表達(dá)報(bào)告基因. 本結(jié)果表明，成功構(gòu)建了含有GFP報(bào)告基因的Smad4基因shRNA慢病毒載體，為進(jìn)一步研究Smad4基因在腫瘤中的作用機(jī)制和動(dòng)物基因治療奠定基礎(chǔ).

圖2慢病毒重組載體LVshSmad4的測(cè)序結(jié)果（略）.

【參考文獻(xiàn)】

［1］ 季國(guó)忠，王學(xué)浩. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βSmad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生中的作用［J］. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)， 2005， 18(6):542-545.

［2］ Jazag A， Ijichi H， Kanai F， et al. Smad4 silencing in pancreatic cancer cell lines using stable RNA interference and gene expression profiles induced by transforming growth factorβ［J］. Oncogene， 2005， 24(4):662-671.

［3］ Ijichi H， Otsuka M， Tateishi K， et al. Smad4independent regulation of p21/WAF1 by transforming growth factorbeta［J］. Oncogene， 2004， 23(5): 10043-10051.

［4］ Imamura T， Kanai F， Kawakami T， et al. Proteomic analysis of the TGFbeta signaling pathway in pancreatic carcinoma cells using stable RNA interference to silence Smad4 expression［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2004， 318(1): 289-296.

［5］ 唐紅衛(wèi)，潘陽(yáng)林，聶勇戰(zhàn)，等. Osteopontin特異性siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在GC9811胃癌細(xì)胞中沉默效應(yīng)的鑒定［J］. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005，26(3)：202-205.

［6］ Singer O， Marr RA， Rockenstein E， et al. Targeting BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimer disease neuropathology in a transgenic model ［J］. Nat Neurosci， 2005， 8(10)： 1343-1349.

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反向遺傳學(xué)研究方法范文第4篇

1917-1919年

歐洲爆發(fā)流感疫癥，導(dǎo)致2,000萬(wàn)人死亡(第一次世界大戰(zhàn)的死亡人數(shù)只是850萬(wàn)人)，是歷史上最嚴(yán)重的流感疫癥。

1957-1958年

1957年2月在中國(guó)貴州爆發(fā)(病毒可能是在1956年從蘇聯(lián)傳來(lái))，其後散播至世界各地。全球受影響的人數(shù)占總?cè)丝诘?0%至30%，但死亡率較1919年的疫癥為低，約為總?cè)丝诘?.25%。

1968-69年

流感從香港開(kāi)始，全球的死亡人數(shù)達(dá)70萬(wàn)人，其中美國(guó)就占3萬(wàn)多人。

1976年

新澤西一名青年染上豬流感，引致恐慌會(huì)爆發(fā)新疫癥，於是大規(guī)模推行疫苗注射。

1986-1993

世界不同地區(qū)發(fā)生數(shù)宗人類(lèi)染上豬流感的病案。

1997年

香港發(fā)生禽流感，原本只影響雞只的病毒亦令人類(lèi)患病。香港政府下令層宰150萬(wàn)雞只。受影響的人數(shù)為18人，其中6人死亡。

中國(guó)是全球流感高發(fā)國(guó)家之一，發(fā)病情況十分嚴(yán)重。由于流感流行，影響生產(chǎn)、學(xué)校停課、醫(yī)院病人驟增等問(wèn)題和現(xiàn)象亦屢見(jiàn)不鮮，而且歷史上幾次流感大流行源于中國(guó)，因此，中國(guó)的流感監(jiān)測(cè)工作對(duì)全球起著舉足輕重的作用。

衛(wèi)生部高度重視流感的監(jiān)測(cè)和防治工作，將流感列為重點(diǎn)防治的傳染病之一，加強(qiáng)對(duì)流感防治工作的領(lǐng)導(dǎo)，定期研究與部署流感防治工作，組織制定流感防治策略，進(jìn)一步加大防治力度，目前已在全國(guó)31個(gè)省開(kāi)展流感監(jiān)測(cè)工作 。

隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人口流動(dòng)頻繁，人口老齡化，流感高危人群比例不斷增加，流感的危害及其監(jiān)測(cè)和防治工作的重要性也進(jìn)一步引起了各級(jí)政府的高度重視 。

近年來(lái)，在中國(guó)，隨著人民生活水平的提高，醫(yī)藥衛(wèi)生條件的改善和醫(yī)療保健知識(shí)的普及，人民群眾對(duì)流感的防治，尤其是流感疫苗的使用高度關(guān)注，流感疫苗的使用量比以前明顯增加。但是，流感疫苗使用不同于其它疫苗，在疫苗種類(lèi)、接種對(duì)象、接種時(shí)間等方面都應(yīng)進(jìn)行科學(xué)的選擇。因此，衛(wèi)生部組織制定了全國(guó)性的流感疫苗免疫策略，以指導(dǎo)各地科學(xué)、規(guī)范、有序地開(kāi)展流感疫苗接種工作，更大程度地發(fā)揮流感疫苗的免疫預(yù)防作用，讓公眾了解關(guān)于流感疫苗使用的科學(xué)知識(shí) 。

目前，我國(guó)已建立了全國(guó)性流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，并具備較好的工作基礎(chǔ)。我們將繼續(xù)加強(qiáng)和完善監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)的工作，使之成為系統(tǒng)、規(guī)范、靈敏、有效的監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，收集各類(lèi)監(jiān)測(cè)信息和資料，綜合分析，為流感的預(yù)防和控制決策提供科學(xué)的依據(jù)。同時(shí)，要逐步開(kāi)展和加強(qiáng)流感對(duì)人群健康的危害和對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的影響及流感疫苗效益等方面的研究。

根據(jù)流感監(jiān)測(cè)和其它方面研究的結(jié)果，不斷對(duì)我國(guó)流感免疫策略進(jìn)行修改和完善，以保護(hù)人民群眾健康，促進(jìn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

流感病毒的快速診斷與流感疫情監(jiān)測(cè)的研究

成果簡(jiǎn)介：該課題研究建立了一套由3種快速診斷方法組成的可用于不同場(chǎng)合進(jìn)行檢測(cè)的快速診斷方法，尤其是搖床吸附微量細(xì)胞板短期培養(yǎng)法是國(guó)內(nèi)首次報(bào)導(dǎo)的一種快速診斷方法。建立了復(fù)蓋寧波市全市范圍的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，共檢測(cè)流感毒株330株，僅2004年就向國(guó)家流感中心上送流感毒株250株，其中50株被國(guó)家流感中心選送到世界衛(wèi)生組織作為篩選流感疫苗的備用株。建立了寧波市2002年以來(lái)甲3型流感病毒HA1基因變異情況的基因進(jìn)化樹(shù)。為寧波市今后的流感病毒防治提供了分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。

所處階段：成熟應(yīng)用階段

完成單位：寧波市疾病預(yù)防控制中心

治流感病毒液及其制備方法

成果簡(jiǎn)介：課題選用名貴中藥，采用高科技手段，發(fā)明專利產(chǎn)品“治流感病毒液”（對(duì)外宣傳和檢驗(yàn)單為“東方神液”）。特點(diǎn)：見(jiàn)效快；降溫快；無(wú)副作用；能對(duì)付任何流感變異性病毒；預(yù)防感冒效果好；可能對(duì)“非典”有作用。該產(chǎn)品市場(chǎng)前景非常廣闊，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界63億人口，平均每人每年患感冒4次。該產(chǎn)品技術(shù)成熟，屬世界領(lǐng)先水平，先后經(jīng)湖南、湖北、黑龍江、安徽、福建等省上萬(wàn)人次應(yīng)用效果確實(shí)好，但目前主要問(wèn)題是：資金缺乏，無(wú)法投產(chǎn)。

所處階段：成熟應(yīng)用階段

完成單位：武漢巨英超王高科技有限公司

流感病毒快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

成果簡(jiǎn)介：建立了一種敏感、快速的流感病原的診斷方法。首先將病人咽拭子標(biāo)本接種狗腎傳代細(xì)胞（MDCK Cell）培養(yǎng)24～48小時(shí)，可以使流感病毒在采集標(biāo)本后立即在細(xì)胞內(nèi)增殖，克服了流感病毒容易在常溫下失去繁殖能力，其RNA易降解的缺點(diǎn)。上述短時(shí)培養(yǎng)結(jié)束后，用流感特異性引物做反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），進(jìn)一步檢測(cè)流感病毒基因，為臨床提供快速、特異檢測(cè)流感病毒基因，確定流感病毒感染與流行的方法。應(yīng)用上述方法，在流感流行期，快速確定流感病原采取消毒、隔離等措施，防止流感流行，對(duì)適合使用疫苗者提供了幫助，取得了巨大的社會(huì)效益。

所處階段：中期階段

完成單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)

我國(guó)馬流感病毒不同分離株生物學(xué)

成果簡(jiǎn)介：本項(xiàng)目分離到了青海馬流感病毒株并采用病毒分離鑒定、血清學(xué)、病理學(xué)、動(dòng)物感染試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸序列比較分析等綜合性手段，對(duì)該病毒株進(jìn)行了深入的研究，證明該毒株為H_3N_8。經(jīng)過(guò)基因組進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，該毒株與我國(guó)香港1992年分離毒株關(guān)系密切，血凝素基因核苷酸同源率達(dá)94%以上，神經(jīng)氨酸酶基因同源率達(dá)96%以上，白基因核苷酸與歐美等國(guó)家的參考毒株同源率達(dá)96%以上，其他基因核苷酸的同源性也達(dá)90%以上，與1974年北京馬流感病毒株和1989年吉林馬流感病毒株明顯不同。研究表明我國(guó)青海省馬流感病毒分離株可能從歐洲經(jīng)由香港傳入大陸。同時(shí)，又將其與其他兩個(gè)病毒株進(jìn)行了比較。建立了該病的診斷方法，進(jìn)行了疫苗制備的初步試驗(yàn)以及明確了我國(guó)馬流感病毒在進(jìn)化系統(tǒng)中的分子生物學(xué)地位，為我國(guó)防制馬流感提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。本研究明確了我國(guó)馬流感病毒間遺傳演化關(guān)系，建立了馬流感HI和瓊擴(kuò)診斷方法，并初步制備了馬流感滅活疫苗。

所處階段：中期階段

完成單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

成人接種卡介苗（BCG）對(duì)流感預(yù)防作用的研究

成果簡(jiǎn)介： 該課題研究通過(guò)接種BCG，提高人機(jī)體的非特異性免疫力，殺滅或遏制病原體，使流感病毒雖然感染人但不致病。本次研究結(jié)果，BCG接種對(duì)流感保護(hù)率達(dá)74.49%。該研究不僅國(guó)內(nèi)，而且國(guó)外都未見(jiàn)到這類(lèi)的研究報(bào)道。它是BCG用途的創(chuàng)新，擴(kuò)大了BCG的使用范圍；開(kāi)創(chuàng)了預(yù)防流感的新途徑，探索出預(yù)防流感的新方法，增加了人類(lèi)征服流感的一種手段。BCG接種簡(jiǎn)單易行，保護(hù)率高，費(fèi)用低，時(shí)效長(zhǎng)，實(shí)用性好。BCG一直廣泛使用在全球；是生物制品中最安全疫苗。使用范圍為全世界；使用對(duì)象幾乎為全人類(lèi)。研究中尚未探討清楚BCG接種后防流感的機(jī)理。

所處階段：成熟應(yīng)用階段

完成單位：淮安市疾病預(yù)防控制中心

穿琥寧抑制流感病毒誘導(dǎo)狗腎傳代細(xì)胞凋亡的研究

成果簡(jiǎn)介： 該研究國(guó)內(nèi)外首次報(bào)告穿琥寧有抗HN和乙型流感病毒誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞凋亡的作用，其作用與病毒唑相似，并從細(xì)胞基因調(diào)控著手研究病毒的致病機(jī)理及穿琥寧的抗病毒作用為臨床防治流感提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，增加了可信度；穿琥寧抑制HN和B型流感病毒誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞AP的抑制率（IR）與利巴韋林類(lèi)似，進(jìn)一步證明穿琥寧是抗流感的良藥，對(duì)該藥在治療流感領(lǐng)域產(chǎn)生了積極的影響；南昌地區(qū)流感由甲型和乙型流感病毒引起，2000年3月發(fā)生的流行由甲型流感病毒所致，為制備疫苗和研究流感病毒提供了新的變異毒株；采用雞胚和狗腎傳代細(xì)胞（MDCK）分離流感病毒可提高病毒分離的陽(yáng)性率。

所處階段：中期階段

完成單位：江西醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院

H5N3亞型流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗的研究

成果簡(jiǎn)介：H5N3細(xì)胞苗的研制填補(bǔ)了禽流感防制的一項(xiàng)空白，該研究居國(guó)際先進(jìn)水平。查新結(jié)果表明，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建全部基因都來(lái)自禽流感病毒的重組禽流感細(xì)胞疫苗株為國(guó)際上首次報(bào)道。rH5N3油乳劑滅活細(xì)胞苗免疫持續(xù)期和對(duì)強(qiáng)毒攻擊保護(hù)性完全達(dá)到了雞胚苗的效果。由于H5N3疫苗株全部基因都來(lái)源于禽流感病毒，生物安全程度高于由人－禽流感病毒拯救的重組病毒；保護(hù)性抗原基因來(lái)自國(guó)內(nèi)最新流行株，因此疫苗株與流行株的抗原匹配性好，免疫效果確實(shí)。此外，采用常規(guī)的血清學(xué)方法就可以進(jìn)行免疫與野毒感染家禽的鑒別診斷。

所處階段：初期階段

完成單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

我國(guó)馬流感病毒不同分離株生物學(xué)特征的研究

成果簡(jiǎn)介：本項(xiàng)目分離到了青海馬流感病毒株并采用病毒分離鑒定、血清學(xué)、病理學(xué)、動(dòng)物感染試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸序列比較分析等綜合性手段，對(duì)該病毒株進(jìn)行了深入的研究，證明該毒株為H_3N_8。經(jīng)過(guò)基因組進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，該毒株與我國(guó)香港1992年分離毒株關(guān)系密切，血凝素基因核苷酸同源率達(dá)94%以上，神經(jīng)氨酸酶基因同源率達(dá)96%以上，白基因核苷酸與歐美等國(guó)家的參考毒株同源率達(dá)96%以上，其他基因核苷酸的同源性也達(dá)90%以上，與1974年北京馬流感病毒株和1989年吉林馬流感病毒株明顯不同。研究表明我國(guó)青海省馬流感病毒分離株可能從歐洲經(jīng)由香港傳入大陸。同時(shí)，又將其與其他兩個(gè)病毒株進(jìn)行了比較。建立了該病的診斷方法，進(jìn)行了疫苗制備的初步試驗(yàn)以及明確了我國(guó)馬流感病毒在進(jìn)化系統(tǒng)中的分子生物學(xué)地位，為我國(guó)防制馬流感提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。

所處階段：中期階段

完成單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

流感嗜血桿菌培養(yǎng)、鑒定及藥物敏感性研究

成果簡(jiǎn)介：該研究對(duì)張家口貧困地區(qū)健康人群及呼吸道感染兒童HI攜帶及感染情況進(jìn)行了調(diào)查研究，并對(duì)分離菌株進(jìn)行生物分型及藥物敏感性研究，結(jié)果表明：不同年齡健康人群HI帶菌率不同；黃連、連翹、金蓮花等10種中草藥對(duì)HI菌株均有不同程度的抑菌作用，且黃連的抑菌作用最強(qiáng)。該研究達(dá)國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。

所處階段：初期階段

完成單位： 張家口醫(yī)學(xué)院

天津地區(qū)流感病毒分子流行病學(xué)和致病性的初步研究

成果簡(jiǎn)介：本項(xiàng)目首次對(duì)天津地區(qū)分離的流感病毒進(jìn)行基因序列分析，從分子水平上了解天津流感病毒的變異特點(diǎn)和規(guī)律。首次應(yīng)用SSCP方法用于流感病毒HA1基因片段點(diǎn)突變的研究，并作為初步篩查流感病毒代表株的方法。比較了甲3亞型“O”相及“D”相毒株、乙型中Victoria與Yamagata系之間致細(xì)胞凋亡能力。該研究建立了一套檢測(cè)病毒的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，為我市預(yù)防控制流感提供了病毒分子生物學(xué)依據(jù)，提高了應(yīng)對(duì)衛(wèi)生突發(fā)事件的能力。

所處階段：成熟應(yīng)用階段

完成單位：天津市衛(wèi)生防病中心

禽H9N2流感病毒感染人的發(fā)現(xiàn)及其基因來(lái)源的研究

成果簡(jiǎn)介：禽H9N2毒株能感染人，并能在自然界中發(fā)生基因重配，同時(shí)重配子能感染人均為國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)，此發(fā)現(xiàn)表明禽流感病毒能直接感染人，也可能原先對(duì)人不致病的禽流感病毒，通過(guò)基因重配形成了對(duì)人致病的重配子。因此上述發(fā)現(xiàn)味徹底揭開(kāi)流感大流行株起源及我國(guó)流感多發(fā)的原因提供了新的科學(xué)依據(jù)，證實(shí)了禽流感味一種新出現(xiàn)的傳染病，為國(guó)際反生物恐怖及流感大流行防治策略制定提供了新內(nèi)容。

所處階段：中期階段

完成單位：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒學(xué)研究所

抗流感藥奧司他韋（二氨基莽草酸酯）合成新工藝

成果簡(jiǎn)介：該產(chǎn)品是其活性代謝產(chǎn)物的藥物前體，其活性代謝產(chǎn)物是強(qiáng)效的選擇性的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。病毒神經(jīng)氨酸酶活性對(duì)新形成的病毒顆粒從被感染細(xì)胞的釋放和感染性病毒在人體內(nèi)進(jìn)一步傳播是關(guān)鍵的。藥物的活性代謝產(chǎn)物抑制甲型和乙型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶。體外在很低的毫微克分子濃度即有抑制效應(yīng)。在體外觀察到活性代謝產(chǎn)物抑制流感病毒生長(zhǎng)，在體內(nèi)也觀察到其抑制流感病毒的復(fù)制和致病性。該產(chǎn)品通過(guò)抑制病毒從被感染的細(xì)胞中釋放，從而減少甲型或乙型流感病毒的傳播。以具有莽草酸骨架結(jié)構(gòu)的1-環(huán)己烯-4-酮甲酸乙酯為起始原料，經(jīng)10步反應(yīng)合成奧司他韋的工藝過(guò)程具有新穎性。

所處階段：初期階段

完成單位：南京萊因醫(yī)藥科技有限公司

雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR快速檢測(cè)A、B型流感病毒的研究

成果簡(jiǎn)介：該研究利用雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)建立一種快速檢測(cè)A、B型流感病毒的方法。根據(jù)A型流感M基因和B型流感HA基因的相對(duì)保守序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物及其相應(yīng)的Taqman探針，建立、優(yōu)化單一和雙重反應(yīng)體系后，利用十倍稀釋法對(duì)已知滴度的流感病毒進(jìn)行梯度稀釋，檢驗(yàn)方法的靈敏度并建立相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，A型、B型流感病毒雙重反應(yīng)的靈敏度分別為2.56 × 10^(-5)和5.0 × 10^(-5) TCID50，說(shuō)明雙重反應(yīng)中A、B型的引物、探針、模板之間無(wú)相互干擾，具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

所處階段：成熟應(yīng)用階段

完成單位：深圳市疾病預(yù)防控制中心

鴨、鵝、豬H5、H7亞型和A型流感病毒通用型抗體檢測(cè)力法的研究

成果簡(jiǎn)介：以桿狀病毒為表達(dá)載體，表達(dá)了禽流感病毒的白基因，與流感病毒白具有相同的生物活性。重組病毒表達(dá)產(chǎn)物與流感病毒抗血清作免疫瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)，均出現(xiàn)明顯清晰的沉淀線，與全病毒瓊擴(kuò)抗原出的沉淀線完全吻合。用重組桿狀病毒的表達(dá)產(chǎn)物制備了A型流感病毒及鴨、蛾、豬H5、H7亞型病毒通用型重組白抗原，H5、H7亞型流感病毒的HI分型抗原和血清。建立了以NP為檢測(cè)抗原鴨、鵝型禽流感間接ELISA檢測(cè)方法，以全病毒作為抗原建立了豬流感抗體間接ELISA診斷方法，確立了最佳反應(yīng)條件和術(shù)式。

所處階段：成熟應(yīng)用階段

完成單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

克感利咽口服液的新藥研究及其抗流感病毒的免疫―自由基機(jī)理

成果簡(jiǎn)介：本課題研制了克感利咽口服液（克感液），并從整體水平、器官水平、細(xì)胞水平和亞分子水平進(jìn)行了多層次、多指標(biāo)的綜合研究?？隙丝烁幸旱目沽鞲胁《咀饔茫⑹状翁岢隹共《镜拿庖?自由基機(jī)理和中藥在抗病毒作用中的重要地位。證明了中藥復(fù)方克感液可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激水平起到非常重要的治療流感作用。此外還通過(guò)黃嘌呤氧化酶體系發(fā)光法和全血吞噬化學(xué)發(fā)光法，證明了克感利咽口服液具有較強(qiáng)的清除活性氧作用。為克感利咽口服液能降低氧化應(yīng)激水平并參與抗病毒的免疫－自由基機(jī)制提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

所處階段：成熟應(yīng)用階段

完成單位：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院/中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院第二臨床醫(yī)藥研究所

我國(guó)兒科流感嗜血桿菌性疾病及分離株耐藥分子流行病學(xué)研究

成果簡(jiǎn)介： 該研究從建立流感嗜血桿菌b型（Hib）標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)和感染菌株分子生物學(xué)研究平臺(tái)入手，引入國(guó)外先進(jìn)培養(yǎng)分離技術(shù)、建立多種特異性抗原、抗體檢測(cè)方法、基因診斷和分型方法，為其感染和耐藥的流行病學(xué)研究提供有效工具。該項(xiàng)目進(jìn)行了以人群（合肥市）為基礎(chǔ)、前瞻性、小兒化膿性腦膜炎三年流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，并進(jìn)行了兩次以醫(yī)院(北京兒童醫(yī)院)為基礎(chǔ)小兒化膿性腦膜炎病原學(xué)調(diào)查。連續(xù)五年對(duì)北京、上海、廣州三所兒童醫(yī)院隨機(jī)選取5059例上呼吸道感染兒童進(jìn)行Hi鼻咽攜帶和菌株常用抗生素敏感性監(jiān)測(cè)，并采用分子生物學(xué)方法對(duì)氨芐青霉素耐藥菌株進(jìn)行耐藥機(jī)制和基因分型研究。

所處階段：中期階段

完成單位：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院

廣州地區(qū)呼吸道感染兒童流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌攜菌和耐藥監(jiān)測(cè)及分離鑒定方法的研究

成果簡(jiǎn)介：該研究首次在廣州地區(qū)進(jìn)行了連續(xù)5年兒童呼吸道感染肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌耐藥監(jiān)測(cè)。首次對(duì)流感嗜血桿菌耐藥性的季節(jié)分布、性別差異、健康兒和上呼吸道感染兒攜流感嗜血桿菌和耐藥性的比較、耐藥表型的分布、多重耐藥等方面進(jìn)行全面、系統(tǒng)地研究,建立了一整套完整的對(duì)菌株的保存，復(fù)蘇的技術(shù)。首次用克林霉素紙片法檢測(cè)廣州地區(qū)對(duì)紅霉素耐藥的肺炎鏈球菌中ermB及mefE基因分布，并比較ermB基因與mefE基因?qū)t霉素耐藥的肺炎鏈球菌的耐藥性；篩選出廣州地區(qū)治療兒童流感嗜血桿菌感染的一線藥物以二代頭孢菌素和/或青霉素類(lèi)/克拉維酸為首選，治療兒童肺炎鏈球菌感染的一線藥物以青霉素/克拉維酸類(lèi)藥物為首選。

所處階段：成熟應(yīng)用階段

完成單位：廣州市兒童醫(yī)院

豬型（H1N1）和馬2（H3N8）亞型流感病毒發(fā)現(xiàn)的意義及其來(lái)源的研究

成果簡(jiǎn)介：該項(xiàng)目采用現(xiàn)場(chǎng)與實(shí)驗(yàn)室相結(jié)合，走協(xié)作道路，應(yīng)用了綜合性方法，即從一般的生物學(xué)至當(dāng)今國(guó)際上先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)。這樣全面系統(tǒng)的研究方式在國(guó)內(nèi)實(shí)屬罕見(jiàn)，在國(guó)際上也屬先進(jìn)之列。不僅使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可信和可靠，而且也保證了實(shí)驗(yàn)在較高的水平上進(jìn)行。豬型（H1N1）流感病毒于1930年就已從美國(guó)豬群中分離到，而后陸續(xù)蔓延到歐洲和亞洲，我國(guó)從1976年開(kāi)始尋找它在豬群中人群中存在的線索，但1991年之前均未能找到它，更未能找到被豬型病毒感染的患者。同樣，馬2（H3N8）亞型毒株于1963年已從美國(guó)邁阿密馬群中被發(fā)現(xiàn)，而后波及到歐洲和亞洲。

所處階段：中期階段

完成單位：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒學(xué)研究所

豬流感（H1-H3亞型單價(jià)和H1-H3亞型雙價(jià)）氫氧化鋁膠滅活疫苗的研究及應(yīng)用

成果簡(jiǎn)介：該項(xiàng)目對(duì)分離自中國(guó)不同地區(qū)、不同亞型SIV流行株的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，篩選出免疫原性好，與全國(guó)范圍流行的H1N1和H3N2亞型各抗原群均有很好抗原反應(yīng)性，對(duì)雞胚高滴度適應(yīng)的流行株作為種毒，接種非免疫雞胚大量增殖后收取無(wú)菌尿囊液，滅活使病毒失去感染和復(fù)制能力但保持其良好的免疫原性；含豬流感病毒尿囊液的蛋白質(zhì)抗原與氫氧化鋁膠混合、濃縮，制成的滅活疫苗，可較長(zhǎng)期存留在豬體，持續(xù)釋放抗原并刺激豬內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生特異性抗H1N1或（和）H3N2亞型豬流感，保護(hù)率高，免疫效果確實(shí)，免疫期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可有效降低高熱、咳嗽、呼吸困難等臨床癥狀，增加平均日增重，顯著改善飼料轉(zhuǎn)化率。適用于中國(guó)不同地區(qū)豬場(chǎng)和豬群對(duì)H1N1和H3N2亞型流感的預(yù)防和緊急免疫。

所處階段：成熟應(yīng)用階段

完成單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

雞新城疫－流感－傳染性囊?。I（腺胃）型傳支四聯(lián)油乳油劑滅活苗的研究

成果簡(jiǎn)介：該課題用新城疫病毒Clone30株和從河北省自行分離的禽流感病毒A/雞/河北/9901/1/99株、傳支病毒腎型S株和腺胃型C株、傳染性囊病病毒EBV91株研制成四聯(lián)油苗，該聯(lián)苗在4-8℃保存12個(gè)月，20-25℃保存3個(gè)月不影響免疫效果，用該疫苗免疫15日齡雛雞后14天保護(hù)率達(dá)90%以上，免疫期達(dá)6個(gè)月。該研究達(dá)國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。