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意識(shí)形態(tài)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第1篇

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞株

Effect of Aminopeptidase Inhibitor on Differentiation Induction Activity of All-trans Retinoic Acid in Human Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells and Its Mechanism

Abstract

This study was purposed to investigate whether aminopeptidase inhibitor，bestatin，can potentiate all-trans retinoic acid (ATRA)-inducing differentiation in NB4 cells，and to explore its mechanism. The NB4 cells were exposed to either bestatin and ATRA alone or in combination，the morphological changes of NB4 cells were observed by optical microscopy，the CD11b expression was measured by flow cytometry，the function of defferentiation cells was analyzed by nitroblue-tetrazolium (NBT) reduction assay，the mRNA expressions of c-myc and c-EBPε in NB4 cells were detected by RT-PCR，the c-Myc protein expression was determined by Western blot. The results showed that treatment with bestatin alone induced no significant changes in morphology，NBT reduction activity and CD11b expression in NB4 cells. NB4 cells incubated with 10 nmol/L ATRA plus 100 μg/ml bestatin showed more morphologic feature of metamyelocyte and band neutrophil than ATRA alone treated cells. 100 μg/ml bestatin enhanced the NBT reduction activity in NB4 cells induced by various concentrations of ATRA (10，20，40 nmol/L). The effects of various concentrations of ATRA in combination with 100μg/ml bestatin were statistically different from the effect of ATRA alone (P

Key words bestatin; ATRA; cell line，NB4; differentiation

氨肽酶抑制劑烏苯美司（bestatin）能抑制氨肽酶N/CD13和亮氨酸氨基肽酶活性，通過增強(qiáng)宿主免疫功能及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用［1，2］。有研究提示，bestatin能夠誘導(dǎo)U937細(xì)胞的分化［1］，國內(nèi)未見報(bào)道。我們以NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，通過形態(tài)、功能和表面分化抗原等多層次實(shí)驗(yàn)研究，了解bestatin是否能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化及（或）對(duì)ATRA的誘導(dǎo)分化作用的增強(qiáng)效應(yīng)，并初步探討其可能的機(jī)理。

材料和方法

主要試劑

Bestatin、ATRA均購于Sigma公司。bestatin以無菌去離子水溶解為1 mg/ml，分裝之后-20℃保存；ATRA以無水乙醇溶解成10-5 mol/L的儲(chǔ)存液，4℃避光保存，使用時(shí)用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液將其稀釋為相應(yīng)工作濃度。NBT為BBI公司產(chǎn)品，以PBS配成0.1%溶液，過濾除菌后4℃避光保存，使用前1周內(nèi)配制。RPMI 1640為Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清為JRH公司產(chǎn)品。CD11b-FITC標(biāo)記單克隆抗體為Teotech公司產(chǎn)品。CD13-PE標(biāo)記單克隆抗體為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。TRIzoL試劑為Gibco公司產(chǎn)品，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq DNA合成酶為Promega公司產(chǎn)品。鼠抗人c-Myc單克隆抗體（c-33）及羊抗人β-Actin多克隆抗體（I-19）均為Santa Cruz公司產(chǎn)品，使用時(shí)以TBST液分別按1∶500和1∶1 000稀釋。ECL顯色液為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

人APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞（浙江大學(xué)腫瘤研究所惠贈(zèng)）及人髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為7×104/ml，以不同濃度ATRA和bestatin單獨(dú)或聯(lián)合處理，于不同時(shí)間收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取空白對(duì)照組及藥物處理各組細(xì)胞懸液，離心，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，用光學(xué)顯微鏡（Leica，40×10）觀察細(xì)胞形態(tài)。

四氮唑藍(lán)（nitroblue-tetrazolium，NBT）還原實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)［3］報(bào)道的方法進(jìn)行?？瞻讓?duì)照組及藥物處理各組細(xì)胞與NBT共孵育后，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下（100×10）觀察，胞漿內(nèi)含有藍(lán)黑色顆粒者為陽性細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。

細(xì)胞表面分化抗原CD11b和CD13的檢測

取對(duì)數(shù)生長期HL-60細(xì)胞和NB4細(xì)胞或藥物處理后各組NB4細(xì)胞離心，用PBS（pH 7.4）洗滌，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105/50 μl，加CD13-PE標(biāo)記單克隆抗體8 μl或CD11b-FITC標(biāo)記單克隆抗體5 μl，避光孵育30分鐘，用PBS洗滌，上流式細(xì)胞儀檢測。以Cellquest 1.2軟件進(jìn)行分析。

細(xì)胞總RNA提取和RT-PCR反應(yīng)

總RNA提取 用TRIzoL一步法抽提細(xì)胞總RNA，按試劑說明書操作。甲醛變性凝膠電泳證實(shí)為完整RNA，紫外分光光度儀定量，A260 nm/280 nm比值均在1.8-2.0之間。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

樣品總RNA 4 μg及隨機(jī)引物0.5 μg，70℃ 5分鐘，立即冰浴，離心。依次加5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μl、10 mmol/L dNTP 1.25 μl、M-MLV 200 U，RNase抑制劑0.6 μl，DEPC水補(bǔ)至反應(yīng)體積為25 μl，于27℃10分鐘，37℃ 60分鐘，72℃ 10分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰浴1分鐘，結(jié)束反應(yīng)。

PCR反應(yīng)

PCR引物為上海Sangon公司合成。引物序列、反應(yīng)條件及產(chǎn)物大小見表1。反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl、10×PCR緩沖液2.5 μl、25 mmol/L MgCl2 1.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、25 μmol/L(c-myc與c-EBPε)或2.5 μmol/L(β-actin)上游及下游引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶1U，用滅菌去離子水補(bǔ)至終體積為25 μl。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)物與循環(huán)之間呈線性關(guān)系范圍。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ml溴化乙錠）電泳，電場強(qiáng)度5 V/cm，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，用凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司）掃描分析條帶灰度，以目的基因與β-actin的灰度比做半定量分析。Table 1. Sequences of primers，condition of PCR and sizes of PCR products（略）

Western blot

收集藥物處理各組細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)為2×106/ml），預(yù)冷的PBS漂洗2次，重懸于100 μl Lammiulis上樣緩沖液（0.125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，5%甘油）中，超聲波裂解，于4℃離心13 000×g）15分鐘，收集上清，蛋白樣品保存于-80℃。按蛋白定量試劑盒（Bio-Rad公司）操作說明書進(jìn)行蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜以5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，分別與抗人c-Myc和抗人β-actin抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育。ECL顯色，顯影于膠片。圖像分析處理系統(tǒng)（Image Station 2000R）掃描，測定條帶的面積和灰度，以二者之乘積進(jìn)行半定量比較分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理

各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，以X±D表示，多組間比較F檢驗(yàn)后采用方差分析及Tukey檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

NB4細(xì)胞表面有CD13的表達(dá)

NB4細(xì)胞CD13陽性表達(dá)率為94.79%（平均熒光強(qiáng)度為1739.59），對(duì)照組HL-60細(xì)胞CD13陽性表達(dá)率為95.49%（平均熒光強(qiáng)度為3107.49）。兩者的CD13平均熒光強(qiáng)度有一定的差異，但陽性百分率差異不明顯。

Bestatin與ATRA聯(lián)合處理后NB4細(xì)胞形態(tài)改變明顯

100 μg/ml bestatin單獨(dú)作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。10 nmol/L ATRA單獨(dú)作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞呈現(xiàn)部分分化的形態(tài)，細(xì)胞核/漿比例減小，核變小有凹陷。100 μg/ml bestatin與10 nmol/L ATRA聯(lián)合處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞形態(tài)分化更加明顯，細(xì)胞漿內(nèi)空泡增多，核凹陷、扭曲更加明顯，形態(tài)似晚幼粒及桿狀核粒細(xì)胞的細(xì)胞增多（圖1）。

Bestatin與ATRA聯(lián)合應(yīng)用后NB4細(xì)胞NBT還原能力明顯增加

以一定濃度（50、75和100 μg/ml）bestatin單獨(dú)處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞的NBT還原能力無明顯改變（與空白對(duì)照組相比較，P>0.05）；不同濃度（10、20和40 nmol/L）ATRA作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞的NBT還原能力呈濃度依賴性增加，與空白對(duì)照組相比，差異明顯。100 μg/ml bestatin與不同濃度ATRA聯(lián)合處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞的NBT陽性率明顯地提高，與單用相應(yīng)濃度ATRA組相比，差異顯著（表2）。Table 2. Effect of bestatin on the NBT reduction activity of NB4 cells induced by ATRA. (略)

100 μg/ml bestatin單獨(dú)處理細(xì)胞不同時(shí)間（48小時(shí)-96小時(shí)），NB4細(xì)胞的NBT還原能力改變不明顯（與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組相比，P>0.05）；10 nmol/L ATRA處理細(xì)胞至72小時(shí)，開始出現(xiàn)NB4細(xì)胞NBT還原能力的增強(qiáng)，并呈時(shí)間依賴性，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，有明顯差異；而10 nmol/L ATRA與100 μg/ml bestatin聯(lián)合處理48小時(shí)，就出現(xiàn)NB4細(xì)胞NBT還原能力的明顯增強(qiáng)，且此作用隨時(shí)間延長而明顯增強(qiáng)，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)單用10 nmol/L ATRA組相比，差異顯著（圖2）。

Bestatin與ATRA聯(lián)合處理后NB4細(xì)胞CD11b表達(dá)明顯增強(qiáng)

100 μg/ml bestatin單獨(dú)處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞CD11b陽性表達(dá)率（MFI為13.4±0.6）稍有增加，但與對(duì)照組（MFI為12.3±0.9）相比，差異不顯著（P>0.05）。10 nmol/L ATRA單獨(dú)處理72小時(shí)之后，NB4細(xì)胞CD11b陽性表達(dá)率（MFI為19.2±4.2）明顯提高，與對(duì)照組相比，差異顯著（P

Bestatin和ATRA單獨(dú)及聯(lián)合處理后NB4細(xì)胞c-EBPε mRNA表達(dá)的變化

NB4細(xì)胞低表達(dá)c-EBPε mRNA。10 nmol/L ATRA處理12小時(shí)之后，NB4細(xì)胞c-EBPε mRNA表達(dá)水平明顯提高，與對(duì)照組相比較，差異顯著(P

Bestatin和ATRA單獨(dú)及聯(lián)合處理后NB4細(xì)胞c-myc表達(dá)的變化

NB4細(xì)胞c-myc mRNA呈高水平表達(dá)。10 nmol/L ATRA單獨(dú)處理4小時(shí)后，NB4細(xì)胞c-myc mRNA表達(dá)下降，與空白對(duì)照組相比較，差異明顯（P

Figure 4. Effect of bestatin and ATRA on the expression of c-myc mRNA of NB4 cells after treatment for 4 hours. M: marker; Lane 1: control. Lane 2: bestatin (100 μg/ml). Lane 3: ATRA (10 nmol/L). Lane 4: bestatin (100 μg/ml) +ATRA (10 nmol/L).

NB4細(xì)胞c-Myc蛋白呈高表達(dá)。10 nmol/L ATRA單獨(dú)處理8小時(shí)后，NB4細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)水平明顯下降（P

討 論

ATRA對(duì)APL的有效治療是白血病誘導(dǎo)分化治療的成功典范。但單用ATRA治療易復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐藥，與其他化療藥物聯(lián)用時(shí)療效有一定的提高，但毒副反應(yīng)增加。因此，尋找能夠增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用而毒副反應(yīng)輕的藥物，成為臨床治療中的關(guān)注問題之一［7，8］。最近，Hirano等［7］根據(jù)NBT還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出，bestatin可能增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，但未做進(jìn)一步的研究。本研究通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)、功能和表面分化抗原等多層次的檢測及分析對(duì)比，表明一定濃度范圍的bestatin本身不能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化，但確能增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。

Hirano等［7］認(rèn)為，bestatin增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用可能與其抑制細(xì)胞表面CD13活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與HL-60細(xì)胞相似，NB4細(xì)胞表面CD13陽性表達(dá)率高達(dá)94.79%，該藥是否通過抑制CD13表達(dá)從而增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的作用，尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。髓系祖細(xì)胞定向分化受轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)。ATRA調(diào)節(jié)與髓細(xì)胞定向分化有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)誘導(dǎo)APL細(xì)胞向中性粒細(xì)胞分化。氨基肽酶N/CD13為Ⅱ型跨膜蛋白，胞內(nèi)端只有8-10個(gè)氨基酸，但最近研究報(bào)道，CD13分子能夠直接參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程［9］。因此，本研究從藥物對(duì)轉(zhuǎn)錄因子影響的角度對(duì)氨肽酶、抑制劑bestatin增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用的可能機(jī)制進(jìn)行了初步探索。c-EBPε為C-EBP家族轉(zhuǎn)錄因子之一，ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向中性粒細(xì)胞方向分化時(shí)，藥物作用2小時(shí)，c-EBPε mRNA表達(dá)水平即開始增高，并持續(xù)增高至細(xì)胞終末分化［10］。而酪氨酸激酶抑制劑STI571增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向中性粒細(xì)胞分化時(shí)，c-EBPε基因及蛋白的表達(dá)水平均未進(jìn)一步增高［8］。本研究結(jié)果顯示，10 nmol/L ATRA處理12小時(shí)后，NB4細(xì)胞c-EBPε mRNA表達(dá)水平明顯上升，而100 μg/ml bestatin與ATRA聯(lián)合處理NB4細(xì)胞時(shí)，c-EBPε mRNA表達(dá)卻未進(jìn)一步增強(qiáng)。這提示bestatin可能與STI571相似，其增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用可能不是通過調(diào)節(jié)c-EBPε表達(dá)。

原癌基因c-myc表達(dá)異常與髓細(xì)胞性白血病的發(fā)生有關(guān)，抑制c-myc表達(dá)可以促使白血病細(xì)胞分化及誘導(dǎo)細(xì)胞終末分化后的凋亡。本研究結(jié)果顯示，10 nmol/L ATRA單獨(dú)作用能夠使NB4細(xì)胞c-myc的表達(dá)下調(diào)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相似［11］。同時(shí)，bestatin與ATRA聯(lián)合應(yīng)用時(shí)c-myc表達(dá)水平的下調(diào)作用較單用ATRA時(shí)更加明顯，且藥物聯(lián)合應(yīng)用各組細(xì)胞的c-myc蛋白表達(dá)水平與藥物誘導(dǎo)的NBT還原能力之間呈明顯的負(fù)相關(guān)。這提示bestatin可能通過與ATRA協(xié)同下調(diào)c-myc表達(dá)，從而增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的作用。1，25-(OH)2 D3在誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化時(shí)，激活蛋白激酶C，引起c-myc表達(dá)下調(diào)［12］。bestatin是否也通過激活蛋白激酶C增強(qiáng)ATRA下調(diào)c-myc的表達(dá)，這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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